Aislamiento y caracterización de una cepa temprana de SARS-CoV-2 durante la epidemia de 2020 en Medellín, Colombia / Isolation and characterization of an early SARS-CoV-2 isolate from the 2020 epidemic in Medellín, Colombia

Introducción. El nuevo coronavirus causante de un brote de enfermedad respiratoria aguda en China en diciembre de 2019 se identificó como SARS-CoV-2. La enfermedad, denominada COVID-19, fue declarada pandemia por la Organización Mundial de la Salud (OMS). El primer caso de COVID-19 en Colombia se reportó el 6 de marzo de 2020; en este estudio se caracterizó un aislamiento temprano del virus SARS-CoV-2 de una muestra recolectada en abril de 2020. Objetivos. Describir y caracterizar una cepa temprana a partir de un aislamiento de SARS-CoV-2 durante la pandemia en Colombia. Materiales y métodos. Se obtuvo una muestra de un paciente con COVID-19 confirmada por qRT-PCR; la muestra fue inoculada en diferentes líneas celulares hasta la aparición del efecto citopático. Para confirmar la presencia de SARS-CoV-2 en el cultivo, se utilizó la qRT-PCR a partir de los sobrenadantes, la inmunofluorescencia indirecta (IFI) en células Vero-E6, así como microscopía electrónica y secuenciación de nueva generación (next-generation sequencing). Resultados. Se confirmó el aislamiento de SARS-CoV-2 en células Vero-E6 por la aparición del efecto citopático tres días después de la infección, así como mediante la qRT-PCR y la IFI positiva con suero de paciente convaleciente positivo para SARS-CoV-2. Además, en las imágenes de microscopía electrónica de trasmisión y de barrido de células infectadas se observaron estructuras compatibles con viriones de SARS-CoV-2. Por último, se obtuvo la secuencia completa del genoma, lo que permitió clasificar el aislamiento como linaje B.1.5. Conclusiones. La evidencia presentada en este artículo permite confirmar el primer aislamiento de SARS-CoV-2 en Colombia. Además, muestra que esta cepa se comporta en cultivo celular de manera similar a lo reportado en la literatura para otros aislamientos y que su composición genética está acorde con la variante predominante en el mundo. Finalmente, se resalta la importancia que tiene el aislamiento viral para la detección de anticuerpos, para la caracterización genotípica y fenotípica de la cepa y para probar compuestos con potencial antiviral.

Introduction: SARS-CoV-2 has been identified as the new coronavirus causing an outbreak of acute respiratory disease in China in December, 2019. This disease, currently named COVID-19, has been declared as a pandemic by the World Health Organization (WHO). The first case of COVID-19 in Colombia was reported on March 6, 2020. Here we characterize an early SARS-CoV-2 isolate from the pandemic recovered in April, 2020. Objective: To describe the isolation and characterization of an early SARS-CoV-2 isolate from the epidemic in Colombia. Materials and methods: A nasopharyngeal specimen from a COVID-19 positive patient was inoculated on different cell lines. To confirm the presence of SARS-CoV-2 on cultures we used qRT-PCR, indirect immunofluorescence assay, transmission and scanning electron microscopy, and next-generation sequencing. Results: We determined the isolation of SARS-CoV-2 in Vero-E6 cells by the appearance of the cytopathic effect three days post-infection and confirmed it by the positive results in the qRT-PCR and the immunofluorescence with convalescent serum. Transmission and scanning electron microscopy images obtained from infected cells showed the presence of structures compatible with SARS-CoV-2. Finally, a complete genome sequence obtained by next-generation sequencing allowed classifying the isolate as B.1.5 lineage. Conclusion: The evidence presented in this article confirms the first isolation of SARS-CoV-2 in Colombia. In addition, it shows that this strain behaves in cell culture in a similar way to that reported in the literature for other isolates and that its genetic composition is consistent with the predominant variant in the world. Finally, points out the importance of viral isolation for the detection of neutralizing antibodies, for the genotypic and phenotypic characterization of the strain and for testing compounds with antiviral potential.

Secuenciación del SARS-CoV-2: la iniciativa tecnológica para fortalecer los sistemas de alerta temprana ante emergencias de salud pública en Latinoamérica y el Caribe / SARS-CoV-2 sequencing: The technological initiative to strengthen early warning systems for public health emergencies in Latin America and the Caribbean

La pandemia de COVID-19 causada por el SARS-CoV-2 es un problema de salud pública sin precedentes en los últimos 100 años, así como la respuesta centrada en la caracterización genómica del SARS-CoV-2 prácticamente en todas las regiones del planeta. Esta pandemia surgió durante la era de la epidemiología genómica impulsada por los continuos avances en la secuenciación de próxima generación. Desde su reciente aparición, la epidemiología genómica permitió la identificación precisa de nuevos linajes o especies de agentes patógenos y la reconstrucción de su variabilidad genética en tiempo real, lo que se hizo evidente en los brotes de influenza H1N1, MERS y SARS. Sin embargo, la escala global y descontrolada de esta pandemia ha generado una situación que obligó a utilizar de forma masiva herramientas de la epidemiología genómica como la rápida identificación del SARS-CoV-2 y el registro de nuevos linajes y su vigilancia activa en todo el mundo. Antes de la pandemia de COVID-19 la disponibilidad de datos genómicos de agentes patógenos circulantes en varios países de Latinoamérica y el Caribe era escasa o nula. Con la llegada del SARS-CoV-2 dicha situación cambió significativamente, aunque la cantidad de información disponible sigue siendo escasa y, en países como Colombia, Brasil, Argentina y Chile, la información genómica del SARS-CoV-2 provino principalmente de grupos de investigación en epidemiología genómica más que como producto de una política o programa de vigilancia en salud pública. Ello evidencia la necesidad de establecer políticas de salud pública orientadas a la implementación de la epidemiología genómica como herramienta para fortalecer los sistemas de vigilancia y alerta temprana frente a amenazas para la salud pública en la región.

The COVID-19 pandemic caused by SARS-CoV-2 is a public health problem on a scale unprecedented in the last 100 years, as has been the response focused on the rapid genomic characterization of SARS-CoV-2 in virtually all regions of the planet. This pandemic emerged during the era of genomic epidemiology, a science fueled by continued advances in next-generation sequencing. Since its recent appearance, genomic epidemiology included the precise identification of new lineages or species of pathogens and the reconstruction of their genetic variability in real time, evidenced in past outbreaks of influenza H1N1, MERS, and SARS. However, the global and uncontrolled scale of this pandemic created a scenario where genomic epidemiology was put into practice en masse, from the rapid identification of SARS-CoV-2 to the registration of new lineages and their active surveillance throughout the world. Prior to the COVID-19 pandemic, the availability of genomic data on circulating pathogens in several Latin America and the Caribbean countries was scarce or nil. With the arrival of SARS-CoV-2, this scenario changed significantly, although the amount of available information remains scarce and, in countries such as Colombia, Brazil, Argentina, and Chile, the genomic information of SARS-CoV-2 was obtained mainly by research groups in genomic epidemiology rather than the product of a public health surveillance policy or program. This indicates the need to establish public health policies aimed at implementing genomic epidemiology as a tool to strengthen surveillance and early warning systems against threats to public health in the region.

Genomic surveillance of the Chikungunya Virus (CHIKV) in Northeast Brazil after the first outbreak in 2014

Abstract INTRODUCTION: We performed an epidemiological surveillance of the Chikungunya (CHIKV) lineages in Bahia after the 2014 East/Central/South African (ECSA) genotype outbreak. METHODS: Reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), viral isolation, and phylogenetic analyses were conducted on serum samples from 605 patients with CHIKV-like symptoms during 2014-2018. RESULTS: Of the 605 samples, 167 were CHIKV-positive. Viral isolation was achieved for 20 samples; their phylogenetic analysis (E2 protein) revealed the presence of ECSA lineage and reinforced the phylogenetic relationship between ECSA and Indian Ocean lineages. CONCLUSIONS: The genomic surveillance of CHIKV showed that only ECSA lineage circulated in Bahia since the 2014 outbreak.

Laboratory investigation of a clustered respiratory tract infection with human adenovirus / 中国人兽共患病学报

In order to investigate the pathogens associated with a clustered event of fever occurred in a kindergarten in Fuzhou,Fujian Province,samples were collected from pediatric cases in the kindergarten and screened for various possible viral agents by real-time PCR.Of 10 respiratory specimens,7 were positive of human adenovirus (HAdV).The positive samples were inoculated into HEp-2 cell-lines for viral isolation.The PCR products of the hypervariable regions of Hexon gene were sequenced,followed by BLAST searches for viral type identification.In comparison with the strains prevalent in domestic or abroad in recent years,the deduced amino acid sequences showed no amino acid mutation in the hypervariable regions of Hexon.Combined with clinical manifestation and field epidemiological data,human adenovirus type 7 could be confirmed as the pathogen linked to the clustered event.

First isolation and identification of Zika virus in China / 中华微生物学和免疫学杂志

Objective To establish a method for the isolation of Zika virus and to gather experi-ences for viral isolation. Methods Suckling mice at age 1-3 days were inoculated with serum samples posi-tive for Zika virus through intracranial injection. All mice were sacrificed 6 days after the injection. Viral nu-cleic acids were extracted from brain, heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle, skin and intestine tissue samples and analyzed by real-time RT-PCR. The supernatants of brain tissues positive for Zika virus were used for subculturing. Nested PCR was performed to amplify the NS5 gene of the isolated virus. The se-quences of NS5 gene were analyzed by using MEGA6. 0 software. Results All of the tissue samples were positive for Zika virus. Higher viral loads were detected in heart and brain tissue samples with cycle thresh-old (Ct) values of 24. 4 and 25. 3, respectively. The second generation of Zika virus was identified in suck-ling mice brain tissues 2 days after infection by using real-time RT-PCR. The amplified product of nested PCR was 972 bp in length. Sequencing analysis showed that the isolated Zika virus ( GDZ16002 strain) be-longed to the Asian lineage. Conclusion A strain of Zika virus was successfully isolated in China by using intracranial injection via a suckling mouse model. The isolated Zika virus belonged to the Asian lineage.

Aislamiento de metapneumovirus humano (HMPV) a partir de muestras clínicas / Human metapneumovirus isolation using clinical respiratory samples

Objetivo: El objetivo de este trabajo fue establecer una metodología para el aislamiento de una cepa de hMPV a partir de hisopados nasales provenientes de pacientes con sintomatología de enfermedad respiratoria aguda. Materiales y métodos: A partir de 12 muestras positivas por fluorescencia para hMPV, se hizo la inoculación en células LLCMK2 (epiteliales de riñón de mono Rhesus) con un medio de mantenimiento que contenía tripsina como proteasa. Se evaluó el efecto citopático diario por 10 días y se tomaron células infectadas que se utilizaron para la prueba de fluorescencia y para confirmar la infección. Se utilizó RT-PCR para corroborar la presencia del virus. Resultados: En 8 de las 12 muestras procesadas, se logró aislar el hMPV, confirmándose la infección por fluorescencia y RT-PCR. Conclusiones: A pesar de ser un virus de crecimiento lento y difícil de aislar según los reportes, en este trabajo se logró aislar el hMPV a partir de muestras clínicas frescas, lo cual resulta de gran utilidad en futuros estudios sobre la patogénesis de la infección respiratoria.

Objective: The aim of this work was to establish a laboratory protocol to isolate human metapneumovirus (hMPV) using as a source confirmed respiratory secretion samples from symptomatic patients. Methods: Twelve respiratory secretion samples confirmed for hMPV by immunofluorescence were inoculated on LLCMK2 primate cells using trypsin to improve the virus binding. The cytopathic effect was evaluated during 10 days, then they were stained with an hMPV specific antibody and culture supernatants were used to detect viral RNA by RT-PCR. Results: We isolated hMPV in 8 out of 12 samples. Monkey cells were susceptible to infection and showed viral replication in both immunocytochemistry and molecular tests and even syncytia formation. Conclusion: Despite the hMPV has low replication rates in culture, causing difficulties to isolate it, in this work we accomplish the viral isolation in eight samples that had been previously confirmed containing hMPV. These clinical isolates are a useful tool to study the respiratory infection pathogenesis.

Aislamientos virales en niños y adultos con infecciones respiratorias agudas / Viral isolations in children and adults with acute respiratory infections

Introducción: las infecciones respiratorias agudas constituyen un grupo de enfermedades que varían desde un catarro común hasta procesos broncopulmonares graves. Entre los agentes causales figuran los virus, los cuales se diseminan por las secreciones respiratorias. Objetivos: mostrar la positividad de aislamientos virales en niños y adultos, vivos o fallecidos, con infecciones respiratorias agudas. Métodos: se efectuó un estudio descriptivo y observacional de 364 pacientes de la provincia de Camagüey, ingresados con el diagnóstico de infecciones respiratorias agudas, desde enero de 2011 hasta diciembre de 2012. A cada enfermo se le llenó una encuesta epidemiológica y se le tomó muestra de exudado nasofaríngeo o biopsia del tejido pulmonar en el caso de los fallecidos. Estas se inocularon en medio de transporte y fueron remitidas a centros especializados para realizar el diagnóstico virológico. Resultados: del total de pacientes con positividad viral, 221 eran niños (30,3 %) y 143 adultos (36,3 %). Entre los virus predominantes figuraron: rinovirus, sincitial respiratorio de tipo A e influenza A (H1N1) pdm09. Conclusiones: más de la cuarta parte de los pacientes tuvieron virus respiratorios. La población infantil fue la más dañada, la de mayor letalidad y coinfecciones de rinovirus con otros virus respiratorios.

Introduction: the acute respiratory infections constitute a group of diseases which vary from a common cold to serious bronchopulmonary processes. Among the causal agents there are the viruses, which are disseminated by the respiratory secretions. Objectives: to show the positivity of viral isolations in children and adults, alive or dead, with acute respiratory infections. Methods: a descriptive and observational study of 364 patients in Camagüey province admitted with the diagnosis of acute respiratory infections was carried out from January, 2011 to December, 2012. An epidemiological survey was filled and samples of nasopharyngeal exudates were taken from each sick person, or lung tissue biopsy were obtained in cases of deads. These were inoculated in transport media and they were referred to specialized centers to carry out the virological diagnosis. Results: of the total of patients with viral positivity, 221 were children (30.3%) and 143 adults (36.3%). Among the predominant viruses there were: rhinovirus, respiratory syncytial type A and influenza A (H1N1) pdm09. Conclusions: more than the fourth part of patients had respiratory virus and the child population was the most affected, with higher lethality and rhinovirus coinfections with other respiratory viruses.

Serotipos de dengue en México durante 2009 y 2010 / Dengue serotypes in México during 2009-2010

Introducción. El dengue en México es un problema prioritario de salud pública. Desde el 2008 el Departamento para la Vigilancia Epidemiológica y Virológica del InDRE implementó un nuevo algoritmo de diagnóstico del dengue, que utiliza la Red de Laboratorios Estatales de Salud Pública, para favorecer la representatividad geográfica, la oportunidad, la sensibilidad y la especificidad de la información que se obtiene. Métodos. La identificación de serotipos se realizó a partir de muestras positivas a la proteína NS1 por ensayo inmunoenzimático (ELISA). Las técnicas que se utilizaron fueron: aislamiento viral, PCR punto final y, desde 2009, RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR). Resultados. En 2009 se analizaron 6,336 muestras; en 2,944 de éstas (46.6%) se identificó el serotipo DENV-1 que predominó sobre el serotipo DENV-2; el serotipo DENV-3 sólo se identificó en dos casos en Guerrero y el serotipo DENV-4 en un caso en Chiapas. En 2010 se analizaron 2,013 muestras. Se identificó algún serotipo en 1,607 muestras (79.88%) y, nuevamente, el serotipo DENV-1 predominó en todo el país. En Chiapas se identificaron los serotipos DENV-1, 2 y 4 y en Jalisco los serotipos DENV-1 y 3. Además, se identificó la circulación del serotipo DENV-3 en Guerrero y apareció el serotipo DENV-4 en San Luis Potosí. Conclusiones. Por la selección de muestras para vigilancia virológica de dengue mediante la positividad a la proteína NS1 y por la introducción de la técnica de qRT-PCR se optimizó la identificación de serotipos circulantes. La alta endemia, los brotes en nuevas regiones, el predominio del serotipo DENV-1 por varios años y la introducción lenta de otros serotipos, principalmente DENV-3, pueden favorecer la aparición de formas clínicas graves de dengue. La vigilancia epidemiológica inteligente del dengue brindará información para un mejor entendimiento de la enfermedad y promoverá acciones para su control y prevención.

Background. Dengue is a public health priority in Mexico. Since 2008, the dengue diagnostic algorithm for epidemiological and virological surveillance has been improved at InDRE and the public health laboratory network (RLESP) to optimize geographic representation, opportunity, sensitivity and specificity of the produced information. Methods. Dengue serotype identification is based on ELISA NS1 positive samples. Methods used are viral isolation, endpoint PCR and, since August 2009, real-time PCR (qRT-PCR). Results. In 2009, 6,336 serum samples were analyzed and 2,944 (46.6%) were positive for serotype identification. DENV-1 was detected in greater proportion followed by DENV-2, and DENV-3 4 was only identified in two cases in Guerrero and DENV-4 in one case in Chiapas. In 2010, 2,013 serum samples were analyzed and 1,607 (78.8%) were positive for serotype identification. DENV-1 was predominant throughout the country. In Chiapas, DENV-1, 2 and 4 were identified and in Jalisco DENV-1 and 3. DENV-3 was identified in Guerrero again and DENV-4 was detected in San Luis Potosí. Conclusions. The selection samples through NS1 positive samples and the introduction of qRT-PCR optimized serotype identification. Hyperendemicity, outbreaks in new geographic areas, the predominant circulation of DENV-1 for several years and the slow reintroduction of the other serotypes, mainly DENV-3, could increase clinical cases of severe dengue. An ¡intelligentí epidemiological surveillance program would offer information for a better understanding of the disease and promote action for its control and prevention.

Estandarización del método de centrifugación en placa para el aislamiento del virus dengue / Rapid centrifugation assay standarization for dengue virus isolation

Se estandarizó el método de centrifugación en placa, para el aislamiento del virus dengue a partir de muestras de suero humano. Se utilizó la línea celular C6/36-HT determinándose los valores óptimos de velocidad de centrifugación, volumen de inóculo, dilución de suero y tiempo de incubación. Posteriormente, 22 muestras de suero con aislamiento viral positivo y cepas referenciales de los cuatro serotipos del virus dengue, fueron procesadas simultáneamente por el método de centrifugación en placa y el método convencional de cultivo en tubo, los aislamientos fueron tipificados mediante inmunofluorescencia indirecta empleando anticuerpos monoclonales. Se optimizó el método de centrifugación en placa inoculando 200 ul de dilución de suero 1/20, centrifugación a 1600 rpm/30 min, presentando sensibilidad de 95,5 por ciento a cinco días postinoculación. Se concluye que el método de centrifugación en placa mejora el porcentaje de aislamiento, con significativa reducción en tiempo de aislamiento del virus dengue.

The plate centrifugation assay was standardized for dengue virus isolation from serum samples. C6/36-HT cells were used determining the optimal values for centrifugation spin speed, inoculum, sera dilution, and incubation time. Then, 22 positive serum samples with viral isolation and viral strains of the four reference dengue virus serotypes were tested simultaneously by the standardized plate centrifugation method and the conventional tube culture. The isolations were typified by indirect immunofluorescent test using monoclonal antibodies. The plate centrifugation method was optimizedto 200 uL of inoculum, dilution of sera 1/20, centrifugation speed at 1600 rpm/30 min, and sensitivity of 95,5 per cent after 5 days post-inoculation. We concluded that the plate centrifugation method increased dengue virus isolation, with a significant reduction of the time of isolation for dengue virus.

Comparación de dos métodos diagnósticos para la detección del virus de influenza porcina / Comparison of two diagnostic methods for the detection of the porcine influenza virus

Due to the lack of a rapid, sensitive and specific test to detect the presence of the porcine influenza virus that offers advantages in field conditions, it is necessary to try different options to obtain a rapid and reliable diagnosis. To do so, samples of nasal mucus, obtained with sterile swabs, were taken from 100 pigs with signs of the presence of such virus. These samples were used to compare two different methods for the detection of the porcine influenza virus. The first one was a commercial test, which is based on a rapid immunochromatography designed to detect the influenza virus type A in poultry. The second method consisted in the viral isolation in cell culture, using MDCK cells sensitized with trypsin; this method, already described in former processes, was compared with the first method, using nasal mucus samples from possible infected pigs with the influenza virus. The results showed that in the immunochromatography test, ten samples were positive, while only eight in the cell culture. Therefore, the immunochromatography was 100% sensitive to detect the influenza virus. The development of this work is important because it offers options in the porcine influenza diagnosis in field conditions, using the rapid immunochromatography test, which suggests that the results must be confirmed in the diagnostic laboratory through viral isolation.

Debido a la falta de una prueba rápida, sensible y específica para detectar la presencia del virus de influenza porcina, que ofrezca la ventaja de utilizar aquélla en condiciones de campo, es necesario probar diferentes opciones para obtener un diagnóstico rápido y confiable. Para ello se utilizaron 100 cerdos con signos de dicho virus; de cada uno de ellos se tomaron muestras de moco nasal obtenidas con hisopos estériles y se compararon dos métodos diferentes para la detección del virus de influenza porcina. El primero de ellos fue una prueba comercial, que está basada en una inmunocromatografía rápida diseñada para detectar virus de influenza tipo A en aves. El segundo método fue el aislamiento viral en cultivo celular en células MDCK sensibilizadas con tripsina; este método, ya descrito en otros trabajos, se comparó con el primer método a partir de muestras de moco nasal de cerdos sospechosos de estar infectados con el virus. Los resultados mostraron que en la prueba de inmunocromatografía, diez muestras fueron positivas y ocho en cultivo celular; la prueba de inmunocromatografía fue 100% sensible para detectar el virus de influenza. El desarrollo de este trabajo es importante, ya que ofrece opciones para el diagnóstico de influenza porcina en campo con el uso de la prueba rápida de inmunocromatografía y sugiere que los resultados deberán confirmarse en el laboratorio de diagnóstico mediante el aislamiento viral.

Aislamiento e identificación de agentes virales en niños con infecciones respiratorias agudas / Isolation and identification of viral agents in children with acute respiratory infectiuos diseases

Las infecciones respiratorias agudas de etiología viral ocupan el primer lugar de morbilidad en la población pediátrica a nivel mundial. El propósito de este estudio fue identificar los virus respiratorios como agentes etiológicos de estas infecciones en los niños que consultaron al Servicio de Pediatría del Hospital Universitario de Caracas. Se incluyeron pacientes entre 0 y 11 años que consultaron por infecciones respiratorias agudas. Se realizó encuesta epidemiológica y clínica y se tomaron las muestras (hisopado nasofaríngeo) para identificación y aislamiento de los virus respiratorios (influenza A y B, para influenza 1, 2, y 3, adenovirus y virus sincitial respiratorio) por inmunofluorescencia y cultivo. Durante 7 años se evaluaron 583 niños, el estudio virológico fue positivo en 83 pacientes (14,2 por ciento) correspondiendo 72,3 por ciento al virus para influenza 1,15,7 por ciento virus influenza A, 6 por ciento influenza B, 4,8 por ciento adenovirus y 1,2 por ciento al virus para influenza 3. Los hallazgos coinciden con la epidemiología en el país para el período del estudio. Se demostró la circulación de los virus para influenza 1 y 3,influenza A y B y adenovirus.

Respiratory viral infections are the first cause of morbidity in children worldwide. The purpose of this study was to know the viral etiology of acute respiratory infections in the Pediatric Department of the “Hospital Universitario de Caracas”. We investigated children 0-11 years with acute respiratory infections for viral etiology. The diagnosis was made by identification of respiratory viruses from nasopharyngeal swab (influenza A and B, parainfluenza 1,2, and 3, adenovirus and respiratory sincitial virus) by inmunofluorescence and culture. 583 patients were investigated. Respiratory viruses were detected in 14,2% cases, with parainfluenza type 1 virus the most commonly detected (72,3%), followed by influenza A 15,7%, influenza B 6%, adenovirus 4,8% and parainfluenza 31,2%. The virology results were similar to the epidemiological reports of the Health Services during the period of the investigation. It was demonstrated the circulation of parainfluenza viruses 1-3, influenza A and B and adenoviruses.

Padronização da técnica de imunoperoxidase para detecção do vírus da diarréia bovina a vírus em cultura de células: Standardization of immunoperoxidase test to detection bovine viral diarrhea virus in cell culture

The aim of this study was to standardize the immunoperoxidase in cell monolayer assay (IPMA) for the etiological diagnosis of bovine viral diarrhea (BVD). The method was standardized in monolayer of primary bovine fetal lung culture inoculated with cytophatic and non-cytophatic classical strains of BVD virus and tested using samples that were considered suspected in the classical technique of viral isolation. The IPMA successfully identified BVD virus and presented better results when heat was used for fixation, BSA 4% solution in PBS was used for blocking and AEC chromogen was used for revelation. Both monoclonal and polycloral antibodies gave good results when used as primary antibodies.

Este estudo teve como objetivo a padronização do ensaio de imunoperoxidase em monocamada de células (IPM) para o diagnóstico etiológico da diarréia bovina a vírus (DBV). O teste foi padronizado em monocamada de cultivo primário de pulmão fetal bovino (PFB) inoculada com as amostras clássicas, citopatogênica (CP) e não citopatogênica (NCP), do vírus da DBV e testado em amostras biológicas suspeitas processadas no teste clássico de isolamento viral (IV). O método de IPM identificou o vírus da DBV, apresentando melhores resultados com a utilização do calor como agente fixador, a soroalbumina bovina a 4% em PBS como bloqueador e a revelação com o cromógeno 3-amino-9-etil-carbazol (AEC). Como anticorpos primários, tanto o anticorpo policlonal como o monoclonal forneceram bons resultados.