Permeabilidade in vitro e in silico de análogos à nifuroxazida com atividade potencial frente a cepas multirresistentes de Staphylococcus aureus / In vitro and in silico permeability of nifuroxazide derivatives with potential activity against multidrug-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) é um dos principais responsáveis por infecções nosocomiais, sendo identificado também em infecções associadas à comunidade. Embora potentes fármacos anti-estafilocócicos estejam disponíveis, as infecções causadas por este patógeno continuam a apresentar significativa morbidade e mortalidade devido ao aparecimento de cepas com resistência a múltiplos fármacos, incluindo vancomicina e teicoplanina. Compostos 5-nitro-heterocíclicos com estrutura análoga à nifuroxazida, antimicrobiano utilizado em infecções gastrintestinais, têm apresentado satisfatória atividade in vitro frente a estas cepas multirresistentes, sendo importante e necessária a avaliação de sua biodisponibilidade oral como próximo estágio no desenvolvimento de um novo fármaco, visando à seleção eficiente e ao aprimoramento da estrutura molecular. Neste contexto, o presente estudo tem por objetivo empregar ensaios in vitro, utilizando células Caco-2, e métodos in silico, utilizando descritores moleculares VolSurf, a fim de analisar a permeabilidade de análogos à nifuroxazida com atividade antimicrobiana apresentando, principalmente, atividade potencial frente a cepas multirresistentes de S. aureus. Empregou-se o método de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) para a avaliação da citotoxicidade. Nos estudos de permeabilidade in vitro foram utilizadas membranas de células Caco-2 cultivadas em placas Transwel® por 21 dias. A quantificação das frações permeadas foi realizada por cromatografia a líquido de alta eficiência com detecção UV (CLAE-UV), com métodos validados de acordo com a Resolução 899/03. Os estudos in silico foram realizados por meio de análise exploratória, pelo método de consenso de análise de componentes principais (CPCA, Consensus Principal Component Analysis), e análise de regressão, por quadrados mínimos parciais (PLS, Partial Least Squares). As células...

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the main pathogens responsible for nosocomial infections, also identified in community-associated infections. Although potent anti-staphylococcal drugs are available, infections caused by this bacteria continues to show significant morbidity and mortality due to the emergence of strains with resistance to multiple drugs, including vancomycin and teicoplanin. The 5-nitro-heterocyclic derivatives of nifuroxazide, which is an antimicrobial used to treat gastrointestinal infections, have shown satisfactory in vitro activity against multidrug-resistant strains of S. aureus. As a next step in the development of a new drug, it is important and necessary the evaluation of the oral bioavailability to achieve an efficient selection and refinement of the molecular structure. In this context, this study aims to develop in vitro assays through Caco-2 cells, and in silico approaches, using VolSurf molecular descriptors, in order to analyze the permeability of 5-nitro-heterocyclic compounds analogues to nifuroxazide with antimicrobial activity, especially showing promising activity against multidrug-resistant Staphylococcus aureus. The MTT (bromide 3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) method was employed to perform the cytotoxicity evaluation. Caco-2 cell monolayers cultivated for 21 days in Transwel® plates were used for the in vitro permeability assays. The quantification of the permeated fractions was done by High Performance Liquid Chromatography with UV detection (HPLC-UV), with validated methods according to the Resolution 899/03. In silico studies were performed through exploratory analysis by consensus principal component analysis (CPCA) and regression analysis by partial least squares (PLS). Caco-2 cells showed suitable cell viability for the permeability studies against all nifuroxazide analogues except the MeTIO (5-nitro-2-thiophilydene 4-methylbenzidrazide). The nifuroxazide...

Padronização das condições para cultura de células Caco-2 visando à obtenção de membranas viáveis ao estudo da permeabilidade in vitro da rifampicina / Standardization of culture Caco-2 cells conditions to obtain viable membranes to study the in vitro permeability of rifampicin

A permeabilidade através do epitélio intestinal tem se tornado um importante aspecto a ser determinado nas avaliações biofarmacotécnicas envolvendo fármacos e medicamentos. A técnica mais empregada para essa determinação in vitro é aquela que utiliza a cultura de células Caco-2. Entretanto, ainda são discutíveis as condições para a realização desses experimentos, uma vez que a padronização das mesmas é fator fundamental para a confiabilidade dos resultados. Nesta tese, foram avaliadas as condições para realização dos estudos de permeabilidade através de membranas de células Caco-2 para a rifampicina, principal fármaco utilizado no tratamento da tuberculose. Para tanto, foram investigados fatores tais como a citotoxicidade da rifampicina em diferentes concentrações, a influência da concentração do fármaco sobre a permeabilidade, do pH de realização dos experimentos e da presença de proteínas do muco intestinal, além da influência de proteínas plasmáticas. Foi também investigado o potencial indutor da rifampicina sobre a expressão da glicoproteína-P (Pgp) e seu impacto na permeabilidade da própria rifampicina. Os estudos foram desenvolvidos utilizando membranas de células Caco-2 provenientes da American Type Culture Collection (ATCC) cultivadas em placas Transwel®, a quantificação da fração permeada foi por cromatografia líquida de alta eficiência com métodos validados. A análise da indução da expressão da Pgp foi realizada por PCR-RT. Demonstrou-se que as concentrações da rifampicina (10,0; 25,0 e 50,0 µg/mL) não ocasionaram danos às células Caco-2 no estudo de citotoxicidade pela técnica que emprega o sal do brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazoli)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT). As concentrações de rifampicina (5,0; 10,0 e 25,0 µg/mL) não resultaram em valores estatisticamente diferentes de permeabilidade aparente (Papp) em células Caco-2 nas condições do estudo. A rifampicina apresentou valor de Papp significativamente maior em pH 6,8 dentre os valores de pH ...

The permeability through the intestinal epithelium has become an important aspect to be determined in evaluations involving drugs and pharmaceutical products. The most common technique for this determination in vitro is one that uses the culture of Caco-2 cells. Nevertheless, the conditions for carrying out such experiments are still questionable, since the standardization of them is essential to the reliability of the results. In this thesis, we evaluate the conditions for the studies of permeability of rifampicin through membranes of Caco-2 cells, the main drug used in the treatment of tuberculosis. To this end, we examined factors such as cytotoxicity of rifampicin at different concentrations, the influence of drug concentration on the permeability, as well as the pH of the experiments, the presence of proteins of intestinal mucus, and the influence of plasma proteins. It was also investigated the potential of rifampicin on the expression of P-glycoprotein (Pgp) and its impact on the permeability of rifampicin itself. The studies were developed using membranes of Caco-2 cells from American Type Culture Collection (ATCC) grown on plates Transwel®, and the quantification of the fraction of drug permeated was obtained by high performance liquid chromatography with validated methods. The analysis of induction of expression of Pgp was performed by RT-PCR. It was demonstrated that the concentrations of rifampicin (10,0; 25,0 and 50,0 µg/mL) did not cause damage to Caco-2 cells in the study of the cytotoxicity technique that uses a bromide salt of 3 - (4,5-dimethyl-2 - thiazol) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium (MTT). The concentrations of rifampicin (5,0; 10,0 and 25,0 µg/mL) did not result in statistically different values of apparent permeability (Papp) in Caco-2 cells under the conditions of the study. Rifampicin showed a value of Papp significantly higher at pH 6.8 in comparison with other measured pH values (5,8 and 7,4). The presence of mucus simulated and ...