Characterization of a Clostridioides difficile ST-293 isolate from a recurrent infection in Argentina

Resumen Clostridioides difficile es un patógeno esporulado oportunista responsable de diarrea asociada a antibióticos en humanos. C. difficile produce 2 toxinas principales: TcdAy TcdB, además de la toxina binaria (CDT), también asociada a la virulencia. Este estudio buscó caracterizar el aislamiento ALCD3, involucrado en un episodio de recurrencia de una infección nosocomial. La caracterización molecular mostró que dicho aislamiento pertenece al toxinotipo 0/v y el análisis por MLST demostró un perfil alélico adk:91, atpA:1, dxr:2, glyA: 1, recA:27, sodA: 1 y tpi:1, lo cual corresponde al ST293 (MLST clado 1). Durante el crecimiento, el aislamiento ALCD3 mostró un incremento temprano de la tasa de esporulación y valores máximos de formas termorresistentes luego de 2 días de incubación. Tanto la cinética de esporulación como la producción de formas termorresistentes fueron más rápidas en el aislamiento ALCD3 que en la cepa de referencia VPI 10463. La germinación en presencia del germinante natural taurocolato fue más rápida en el aislamiento ALCD3 que en la cepa VPI 10463, lo que indica que aquel comienza la hidrólisis del córtex antes. También, el co-germinante glicina indujo una rápida liberación de ácido dipicolínico en ALCD3. Estos hallazgos indican que el aislamiento ALCD3 es particularmente eficiente en la esporulación y en la germinación. El presente trabajo representa el primer informe de la circulación de C. difficile ST293 en Argentina. La habilidad del aislamiento ALCD3 para producir toxinas y su alta capacidad de esporulación/germinación son características claves compatibles con un alto potencial de diseminación e inducción de infecciones recurrentes.

Abstract Clostridioides difficile is an opportunistic spore-forming pathogen responsible for antibiotic-associated diarrhea in humans. C. difficile produces two main toxins: TcdA and TcdB as well as a third toxin named binary toxin (CDT) that is also involved in virulence. The present study aimed at characterizing the C. difficile isolate ALCD3 involved in a relapse episode of nosocomial infection. Molecular characterization showed that isolate ALCD3 belongs to tox-inotype 0/v and the MLST analysis demonstrated allelic profile adk:91, atpA:1, dxr:2, glyA: 1, recA:27, sodA: 1 and tpi:1 which corresponds to ST293 (MLST clade: 1). During growth, isolate ALCD3 showed an early increase in the sporulation ratio as well as maximal values of heat resis-tant forms after 2 days of incubation. Both sporulation kinetics and production of heat resistant forms were faster for isolate ALCD3 than for the reference strain VPI 10463. Germination in the presence of the natural germinant taurocholate was faster for isolate ALCD3 than for strain VPI 10463, which indicates that isolate ALCD3 starts cortex hydrolysis earlier than strain VPI 10463. Furthermore, the co-germinant glycine, induces rapid release of dipicolinic acid (DPA) in isolate ALCD3. These findings indicate that isolate ALCD3 is particularly efficient in both sporulation and germination. The present work represents the first report of the circulation of C. difficile ST293 in Argentina. The ability of isolate ALCD3 to produce toxins and its high sporulation/germination capacity are key features compatible with a microorganism with high dissemination potential and the possibility of inducing recurrent infections.

In-vitro anticoccidial potential of Saccharum officinarum extract against Eimeria oocysts / Potencial in vitro anti coccidial de un extracto de Saccharum officinarum contra oocistos de Eimeria

Present study was conducted to evaluate the effect of aqueous methanolic extract from Saccharum officinarum on the sporulation and morphology of oocysts of four Eimeria species (Eimeria tenella, E. necatrix, E. mitis, E. brunetti) of poultry. Sporulation inhibition bioassay was used to evaluate the activity of Saccharum officinarum extract (SOE) on the sporulation of coccidian oocysts. In this assay, unsporulated oocysts were exposed to six concentrations of S. officinarum in 10 percent dimethyl sulfoxide solution (w/v; 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 and 0.31 percent) while DMSO and potassium dichromate solution (K2Cr2O7) served as control groups. The Petri dishes were partially covered to allow the passage of oxygen and incubated at 25-29° C for 48 h, providing 60-80 percent humidity. The sporulation of the oocyst was confirmed by examining sporocysts under inverted microscope at 40x. Results showed anticoccidial activity of SOE against all Eimeria species as proved by its ability to inhibit the sporulation of the oocysts under laboratory conditions. Inhibition of sporulation was observed in dose dependent manner. S. officinarum extract at higher dose also damaged the normal morphology and shape of oocysts of Eimeria species.

El presente estudio se llevó a cabo para evaluar el efecto del extracto metanólico acuoso a partir de Saccharum officinarum en la esporulación de los ooquistes y la morfología de cuatro especies de Eimeria tenella (Eimeria, E. necatrix, E. mitis, E. brunetti) de aves de corral. Bioensayos de la inhibición de la esporulación se utilizaron para evaluar la actividad de extracto de Saccharum officinarum (SOE) en la esporulación de ooquistes de coccidios. En este ensayo, los ooquistes no esporulados se expusieron a seis concentraciones de S. officinarum en solución de dimetil sulfóxido 10 por ciento (w / v; 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625 y 0,31 por ciento), mientras DMSO y una solución de dicromato de potasio (K2Cr2O7) sirvió como grupos de control. Las placas de Petri se cubren parcialmente para permitir el paso de oxígeno y se incubaron a 25-29° C durante 48 h, proporcionando el 60-80 por ciento de humedad. La esporulación de los ooquistes fue confirmado mediante el examen de esporoquistes bajo microscopio invertido a 40x. Los resultados mostraron actividad anticoccidial de SOE contra todas las especies de Eimeria como se ha demostrado por su capacidad para inhibir la esporulación de los ooquistes en condiciones de laboratorio. Se observó una inhibición de la esporulación de manera dependiente de la dosis. Extracto de S. officinarum en dosis más alta también dañó la morfología normal y la forma de ooquistes de las especies de Eimeria.

Variación temporal a Microcyclus ulei en los clones de caucho FX 3864 y FX 4098 en condiciones controladas / Temporal variation to Microcyclus ulei in rubber tree clones FX 3864 and FX 4098 under controlled conditions

Este estudio tuvo como objetivo evaluar la variación temporal de los principales componentes fisiológicos asociados a la reacción de dos clones (FX 3864 y FX 4098) de Hevea brasiliensis a Microcyclus ulei en condiciones controladas. Las inoculaciones se realizaron en cámara húmeda a 23 ºC, una humedad relativa superior al 90% y un fotoperíodo de 12 h. Con un modelo de medidas repetidas en el tiempo y mediante correlaciones se analizaron cuatro variables: severidad de ataque (SA), intensidad de esporulación conidial (IE), tamaño de lesión (TL) y frecuencia de infección (FI). M. ulei generó síntomas en los dos clones a los 4 días después de la inoculación. Los signos de la enfermedad (IE= 3) se manifestaron a los 8 días en el clon FX 3864 y a los 12 días en el clon FX 098. FX 3864 presentó la mayor susceptibilidad a M. ulei (mayor severidad y una esporulación alta, IE= 4). En general, se observó una influencia del tiempo en la reacción de cada clon para las variables SA, IE y TL. Altas correlaciones significativas se encontraron entre SA y las variables IE, TL y FI, excepto en el día 12 para IE. Este estudio permite concluir que en condiciones controladas la intensidad y la frecuencia de los síntomas así como el grado de esporulación producidos por M. ulei cambian significativamente a través del tiempo y esta variación está influenciada a su vez por el nivel de susceptibilidad a M. ulei presentado por cada clon de H. brasiliensis.

This study aimed to evaluate the effect of temporal variation on the main physiological components associated with the reaction to Microcyclus ulei of two rubber tree clones of Hevea brasiliensis under controlled conditions. Inoculations were performed in a moist chamber at 23 °C, a relative humidity higher than 90% and a photoperiod of 12 h. The variables severity of attack (SA), conidial sporulation intensity (IE), lesion size (TL) and infection frequency (IF) were analyzed with a repeated over time measurements model and also with correlations. M. ulei produced symptoms (SA, TL, FI) in both rubber tree clones 4 days after inoculation. Signs of the disease (IE = 3) appeared in the FX 3864 at day 8th and in the FX 4098 at day 12th. FX 3864 presented higher susceptibility to M. ulei (greater severity and high sporulation, with IE = 4). In general, the time influenced the reaction of each clone, especially in the variables SA, IE and TL. High significant correlations were found between SA and the variables IE, TL and FI, except on day 12 for IE. It was concluded that intensity and frequency of symptoms and the degree of sporulation produced by M. ulei change significantly over time under controlled conditions and this variation is influenced also by the level of susceptibility to M. ulei showed by each clone of H. brasiliensis.

Formación de endosporas en Clostridium y su interacción con el proceso de solventogénesis / Endospore formation in Clostridium and its interaction with solventogenesis

La solventogénesis y la esporulación son mecanismos de las células de Clostridium para resistir ambientes hostiles. Este segundo proceso ha sido estudiado utilizando como modelo lo que sucede con Bacillus, aunque se reconocen diferencias marcadas entre los dos géneros especialmente en el inicio, específicamente en los eventos por medio de los que se da la fosforilación del regulador maestro Spo0A. En la actualidad se ha avalado la teoría que afirma que tres histidin quinasas huérfanas, diferentes a las proteínas Spo0B (histidin quinasa) y Spo0F(fosfotransferasa) en Bacillus, son las encargadas de fosforilar en Clostridium de forma directa a Spo0A, que posteriormente activa la transcripción de diferentes factores sigma relacionados, de forma similar en los dos géneros bacterianos. La proteína Spo0A, perteneciente a la familia de reguladores de respuesta, se comporta como una entidad regulatoria global que tiene injerencia sobre los procesos de formación de esporas y solventes, modulando genes necesarios para que se produzcan acetona y butanol, además de genes de esporulación. El entendimiento de este proceso ha llevado a los investigadores a emplear diferentes técnicas moleculares que permitan incrementar la producción de solventes, así como eliminar la propiedad de las células de producir endosporas. Por tal razón, este escrito presenta un resumen de estas dos redes de expresión de genes, conectadas por el regulador maestro Spo0A.

Solventogenesis and sporulation are mechanisms used by Clostridium cells to resist hostile environments. Sporulation has been studied using as a model what happens with Bacillus, but marked differences were recognized, particularly in the events that led the phosphorylation of the master controller Spo0A. Currently, a theory that claims that three orphan histidine kinases, different from Spo0B (histidin kinase) and spo0F (phosphotransferase) proteins in Bacillus, phosphorilate directly Spo0A in Clostridium activating transcription of different sigma factors which are similar in the two bacterial genera, has been supported. Spo0A protein, which belongs to the family of response regulators, behaves as an entity that has global regulatory interference on the processes of spore formation and solvents, modulating genes necessary to produce acetone and butanol. The understanding of this process has led researchers to employ different molecular techniques that increase the production of solvents, and remove the property of the cells to produce endospores. Reason why, this paper presents an updated summary of these two gene expression networks, connected by the master regulator spo0A.

Regulación del inicio de la esporulación e histidina cinasas: un análisis comparativo entre bacillus subtilis y el grupo bacillus cereus / Sporulation start and hystidine kinase regulation: a comparative analysis of bacillus subtilis the group of bacillus cereus / Regulamentação do início da esporulação e histidina-cinase: uma análise comparativa entre bacillus subtilis e o grupo bacillus cereus

La esporulación, que es una respuesta de quorum sensing, es un proceso de diferenciación celular mediado por moléculas de señalización, señales fisiológicas y ambientales. Se sabe que Bacillus subtilis detecta las señales metabólicas y ambientales y éstas son integradas a un sistema de transferencia secuencial de fosfatos. Las señales son detectadas por histidina cinasas que se autofosforilan y fosforilan, a su vez, a proteínas que actúan como reguladores de respuesta y activan la expresión de genes específicos de esporulación. Dada la importancia de B. cereus desde el punto de vista epidemiológico, el potencial para bioterrorismo de B. anthracis y la importancia en biotecnología agrícola de B. thuringiensis, la investigación sobre los mecanismos moleculares de señalización y la regulación del inicio de la esporulación en estas bacterias del grupo B. cereus reviste especial interés. En esta revisión se discute la literatura sobre este tema, haciendo hincapié en las histidina cinasas y en el análisis comparativo de los genomas de B. subtilis y del grupo de B. cereus, en cuanto a las secuencias de posibles histidina cinasas y reguladores de respuesta. Cabe destacar que en los genomas del grupo B. cereus hay mayor número de histidina cinasas (10 a 14) y de reguladores de respuesta (7 a 11) putativos que en B. subtilis (6 histidina cinasas y 6 reguladores de respuesta), lo cual sugiere una mayor capacidad para responder a estímulos ambientales y metabólicos en estas bacterias.

Sporulation is a quorum sensing response and a cellular differentiation process regulated by signalling molecules and physiological and environmental signals. The regulation of sporulation initiation has been extensively studied in Bacillus subtilis and occurs through phosphorelay. B. subtilis detects metabolic and environmental signals through histidine kinases that are autophosphorylated and then transfer the phosphate group to response regulators, activating the expression of sporulation genes. However, there are other important sporulated bacilli like those from the B. cereus group. B. cereus toxins are related to food-borne intoxication, B. anthracis may be used as biological weapon in bioterrorism, and B. thuringiensis is an excellent biological control agent. Therefore, it is critical to understand the signalling processes that control sporulation initiation and the toxin synthesis. This review summarizes known literature about regulation of initiation of sporulation in the B. cereus group focusing in the role of histidine kinases and the putative open reading frames of these sensors in B. subtilis and B. thuringiensis. The genomes of the B. cereus group have 10 to 14 putative histidine kinases and 7 to 11 response regulators, compared to 6 histidine kinases and 6 response regulators in B. subtilis, implying that this last bacteria should have a lower capacity to respond to environmental and metabolic signals.

A esporulação, que é uma resposta de quorum sensing, é um processo de diferenciação celular mediado por moléculas de sinalização, sinais fisiológicas e ambientais. Sabe-se que Bacillus subtilis detecta os sinais metabólicos e ambientais e estes são integrados a um sistema de transferência sequencial de fosfatos. Os sinais são detectados por histidina cinase que, por sua vez, se autofosforilam e fosforilam, em proteínas que atuam como reguladores de resposta e que ativam a expresão de genes específicos de esporulação. Devido à importância de B. cereus do ponto de vista epidemiológico, o potencial para bioterrorismo de B. anthracis e a importância em biotecnologia agrícola de B. thuringiensis, a investigação sobre os mecanismos moleculares de sinalização e a regulamentação do início da esporulação em estas bactérias do grupo B. cereus revestem especial interesse. Nesta revisão se discute a literatura sobre este tema, colocando especial atenção nas histidina cinases, e na análise comparativa dos genomas de B. subtilis e do grupo de B. cereus, em relação às sequências de posíveis histidina cinases e reguladores de resposta. Cabe destacar que nos genomas do grupo B. cereus há maior número de histidina cinases (10 a 14) e de reguladores de resposta (7 a 11) putativos que en B. subtilis (6 histidina cinases e 6 reguladores de resposta), o que sugere uma maior capacidade para responder a estímulos ambientais e metabólicos nestas bactérias.

Efecto del sustrato y la exposición a la luz en la producción de una cepa de Trichoderma sp / Effects of substrate and light exposition in the production of Trichoderma sp

Con el fin de evaluar el efecto de las condiciones de luz sobre la producción de biomasa de una cepa de Trichoderma sp. en fermentación sólida y sumergida, se probaron medios arroz 53 por ciento (p/p), arroz 53 por ciento (p/p)-melaza 3 por ciento(p/p) y arroz 53 por ciento (p/p)-melaza 10 por ciento (p/p) en agua destilada, con incubación 25oC y períodos de luz constante y fotoperíodo 24 h luz/24 h oscuridad durante 8 días. Los parámetros estimados fueron densidad poblacional (conidios/mL), germinación de esporas a 24 horas y porcentaje de pureza. Los resultados indicaron que el proceso de fermentación sólida empleando como sustrato arroz-agua destilada a 25ðC y la exposición constante a la luz permitió mayor recuperación de conidios (45x1018 conidios/mL), con 96 por ciento de germinación a 24 horas y una pureza estimada de 92,1por ciento. En la fermentación sumergida se obtuvo un porcentaje de pureza del 76,8 por ciento y la germinación de conidios a las 24 h fue de 91,2 por ciento, mostrando como desventaja un bajo porcentaje de pureza frente a la fermentación sólida.

In order to evaluate the effect of temperature and light conditions on biomass production of a Trichoderma sp. strain, three culture media were tested: rice 53% (w/w), rice 53% (w/w) -molasses 3% (w/w) and rice 53% (w/w)-molasses 10% (w/w) in distilled water. Incubation conditions were: 25°C, constant light and a photoperiod of 24 h light/24 h darkness during 8 days. The evaluated parameters were population density (conidia/mL), spore germination after 24 hours and purity percentage. The results showed that solid fermentation using rice - distilled water as substrate at 25°C and constant light, allowedthe highest conidia yield (45x1018 conidia/mL), 96% germination after 24 hours, and 92.1% purity. The liquid fermentation rendered a purityof 76.8% and conidia germination of 91.2% after 24 hours, showing a disadvantageous lower purity percentage compared to solidfermentation.

Com a finalidade de avaliar o efeito das condições de luz sobre a produção de biomassa de uma cepa de Trichoderma sp, em fermentação sólida e submergida, foram testados diferentes meios: arroz 53% (p/p), arroz 53% (p/p)-melaço 3% (p/p) e arroz 53% (p/p)-melaço 10% (p/p) em água destilada, com incubação 25°C e períodos de luz constante e fotoperíodo 24 h luz/24 h escuridão durante 8 dias. Os parâmetros estimados foram densidade populacional (conídios/mL), germinação de esporas a 24 horas e porcentagem de pureza. Os resultados indicaram que o processo de fermentação sólida usando como substrato arroz-água destilada a 25ºC e exposição constante à luz, permitiu maior recuperação de conídios (45x1018 conídios/mL), com 96% de germinação a 24 horas e uma pureza estimada de 92,1%. Na fermentação submergida obteve-se um percentual de pureza de 76,8% e a germinação de conídios as 24 h foi de 91,2%, mostrando como desvantagem um baixo percentual de pureza frente à fermentação sólida.