ABSTRACT
Introducción: El análisis de espermatograma es utilizado como una prueba diagnóstica de la calidad seminal. Recientemente, el análisis de fragmentación espermática ha tomado importancia dado los diversos estudios que han demostrado que la integridad del ADN en el espermatozoide afectaría los resultados clínicos en los tratamientos de reproducción asistida. Objetivos: Identificar las variables analizadas en un espermatograma que predecirían independientemente el índice de fragmentación de ADN espermático (IFE). Diseño: Estudio retrospectivo, comparativo. Instituciones: Grupo PRANOR, Reprogenetics Latinoamerica, Clínica Concebir, Lima, Perú. Material biológico: Espermatozoides. Métodos: Se comparó variables individuales y dos modelos: el primero consideró el porcentaje de vialidad espermática y la edad del paciente; el segundo modelo incluyó el porcentaje de espermatozoides motiles y la edad. Se hizo análisis de regresión logística. Principales medidas de resultados: Viabilidad espermática, edad. Resultados: El análisis multivariado demostró que los dos modelos fueron significantemente superiores a las variables individuales (p<0,01). El primer modelo tuvo valores de coeficiente no estandarizados (IC95%) de 0,200 (0,082 a 0,318) y -0,146 (-0,206 a -0,086), respectivamente. El segundo modelo tuvo valores de coeficiente no estandarizados (IC95%) de -0,099 (-0,157 a -0,042) y 0,219 (0,99 a 0,339), respectivamente. El análisis de regresión logística demostró que el porcentaje de viabilidad espermática y la edad del paciente predijeron la probabilidad de tener un IFE superior al 30% con valores de coeficiente no estandarizados de edad de IC95% 0,034 (0,015 a 0,053) y porcentaje de viabilidad de -0,043 (0,034 a 0,052). Adicionalmente, el segundo modelo tuvo IC95% de -0,04 (-0,031 a -0,049) y 0,035 (0,017 a 0,053), respectivamente. Finalmente, una curva ROC construida para determinar la superioridad de algún modelo sobre las variables individuales demostró que las áreas bajo la curva (ABC) del modelo 1 (edad y viabilidad espermática) fue 0,727 (IC95% = 0,665 a 0,790) y el modelo 2 (edad y motilidad total de espermatozoides) 0,675 (IC95% = 0,606 a 0,744), comparadas con las ABC del porcentaje de viabilidad espermática = 0,295 (IC95% = 0,229 a 0,362), motilidad total de espermatozoides ABC = 0,333 (IC95% = 0,264 a 0,403) y edad de paciente con ABC 0,584 (IC95% = 0,510 a 0,658). Conclusiones: La edad, motilidad y viabilidad espermática correlacionaron de manera independiente con el IFE y, por tanto, estas variables podrían ser usadas como predictores del porcentaje de fragmentación de ADN.
Introduction: The spermatogram is used as a test of seminal quality. Recently, the sperm fragmentation test has demonstrated importance as sperm DNA integrity would affect clinical results in assisted reproduction treatments. Objectives: To determine spermatogram variables that would independently predict sperm DNA fragmentation index (SFI). Design: Retrospective, comparative study. Settings: Grupo PRANOR, Reprogenetics Latinoamerica, Clinica Concebir, Lima, Peru. Biologic material: Sperm. Methods: Individual variables and two models were compared: the first model considered percentage of sperm viability and patients age; the second model included percentage of motile sperms and age. Logistic regression analysis was done. Main outcome measures: Sperm viability, age. Results: Multivariate analysis showed that both models were significantly superior to individuals variables (p<0.01). The first model had non standardized coefficient values (95%CI) respectively of 0.200 (0.082 to 0.318) and -0.146 (-0.206 to -0.086). The second model had non standardized coefficient values (95%CI) respectively of -0.099 (-0.157 to -0.042) and 0.219 (0.99 to 0.339). Logistic regression analysis showed that the percentage of sperm viability and patients age predicted the probability of having an SFI over 30% with age non standardized coefficient values of 95%IC 0.034 (0.015 to 0.053) and viability percentage of -0.043 (0.034 to 0.052). Additionally the second model had 95%CI respectively of -0.04 (-0.031 to -0.049) and 0.035 (0.017 to 0.053). Finally, a ROC curve to determine the superiority of some model over individual variables showed that areas under the curve (ABC) of model 1 (age and sperm viability) was 0.727 (95%CI = 0.665 to 0.790) and model 2 (age and sperm total motility) 0.675 (95%CI = 0.606 to 0.744), compared with ABC of percentage of sperm viability = 0.295 (95%CI = 0.229 to 0.362), sperm total motility ABC = 0.333 (95%CI = 0.264 to 0.403) and patients age with ABC 0.584 (95%CI = 0.510 to 0.658). Conclusions: Age, and sperm motility and viability independently correlated with SFI and consequently these variables could be used as predictors of DNA fragmentation percentage.
ABSTRACT
El objetivo de este estudio fue determinar si la integridad de la membrana plasmática y el ADN de los espermatozoides pueden ser afectados por la centrifugación realizada en el proceso de lavado y selección. Los espermatozoides fueron sometidos a diferentes tiempos de centrifugación (10, 30 y 45 min); se utilizó un control negativo con espermatozoides no centrifugados y un control positivo con espermatozoides sometidos a estrés oxidativo con peroxido de hidrógeno (H2O2) (200 μM). Para evaluar la integridad de la membrana se utilizó la prueba hipoosmótica (HOST) y para evaluar la fragmentación del ADN se utilizó el ensayo cometa: El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Fisher. La centrifugación durante 10, 30 y 45 min, presentó un efecto estadísticamente significativo sobre el daño en el ADN, respecto de los espermatozoides no centrifugados (p<0.05). Además, se observó diferencia estadística significa (p<0.05) entre los espermatozoides centrifugados a diferentes tiempos con respecto al control positivo realizado con H2O2 (200 μM). La comparación de medias no indicó diferencia estadística significativa entre los espermatozoides no centrifugados y los centrifugados por un periodo de 10 y 30 min (p>0.05) en la reacción positiva a la prueba HOST, lo cual sí sucedió (p<0.05) al comparar los no centrifugados y los centrifugados por 45 min. El control positivo realizado con H2O2 presentó diferencia significativa (p<0.05) con el resto de los tratamientos. En conclusión, los resultados del presente trabajo sugieren que la centrifugación de los espermatozoides durante 10, 30 ó 45 min a 700 x g para la realización del gradiente diferencial de Percoll, tiene un efecto deletéreo sobre el ADN de los espermatozoides bovinos y que la centrifugación por 45 min además de causar daño en el ADN produce pérdida de la integridad de la membrana plasmática.
O objetivo de este estudo foi determinar se a integridade da membrana plasmática e o DNA dos espermatozóides podem ser afetados pela centrifugação realizada no processo de lavado e seleção. Os espermatozóides foram submetidos a diferentes tempos de centrifugação (10, 30 e 45 min); foi utilizado um controle negativo com espermatozóides não centrifugados e um controle positivo com espermatozóides submetidos a estresse oxidativo com peróxido de hidrogênio (H2O2) (200 μM). Para avaliar a integridade da membrana foi utilizado o teste hipoosmótica (HOST) e para avaliar a fragmentação do DNA Fo utilizado o ensaio cometa: A análise estatística se realizou mediante o teste de Fisher. A centrifugação durante 10, 30 e 45 min, apresentou um efeito estatisticamente significativo sobre o dano no DNA, em relação aos espermatozóides não centrifugados (p<0.05). Além disto, observou-se diferença estatisticamente significativa (p<0.05) entre os espermatozóides centrifugados a diferentes tempos em relação ao controle positivo realizado com H2O2 (200 μM). A comparação de medias não detectou diferença estatisticamente significativa entre os espermatozóides não centrifugados e os centrifugados por um período de 10 e 30 min (p>0.05) na reação positiva à prova HOST, o qual ocorreu ao comparar os não centrifugados e os centrifugados por 45 min (p<0,05). O controle positivo realizado com H2O2 apresentou diferença significativa (p<0.05) quando comparado contra os outros tratamentos. Em conclusão, os resultados do presente trabalho sugerem que a centrifugação dos espermatozóides durante 10, 30 ou 45 min a 700 x g para realização do gradiente diferencial de percoll, têm um efeito deletério sobre o DNA dos espermatozóides bovinos e que a centrifugação por 45 min além de causar dano no DNA produz perda da integridade da membrana plasmática.
The aim of this study was to evaluate the effects of different times of centrifugation on plasma membrane integrity and DNA of bovine sperm cells, by means of the hyposmotic test (HOST) and the comet assay, respectively. The sperm cells were centrifuged at 700 x g for 10, 30 or 45 min. No-centrifuged thawed semen served as negative control whereas hydrogen peroxide (H2O2) (200 mM) treated sperm cells were used as a positive control. The results indicate that while the integrity of the plasma membrane was not affected by centrifugation, bovine sperm DNA was damaged independently of centrifugation times. Significant differences between negative control and treatments were found (p<0.05) and in the same way, between treatments and positive control, where the damage for oxidative stress was greater. These results indicate that centrifugation could be detrimental for in vitro bovine embryo production. Additionally, some grade of DNA fragmentation in not centrifuged sperm cells (negative control) was registered, suggesting that DNA of bovine sperm cells could be affected by other factors, probably freezing procedure.