Structural and physical-chemical analyses of sulfated polysaccharidesfrom the sea lettuce Ulva lactuca and their effects on thrombin generation / Análises estrutural e físico-química de polissacarídeos sulfatados da alface do mar Ulva lactuca e seus efeitos sobre geração de trombina

Ulva lactuca (Chlorophyceae) has biotechnologically-important sulfated-polysaccharides (Ul-SPs), but their potentials on thrombin generation (TG) are unknown. This study analyzed the structural and physicalchemical features of the Ul-SPs as modulators of TG. Proteolytic digestion yielded (13.13%) extract containing sulfate (20.43%) and total sugars (65.72%), besides ulvan consisting of rhamnose, xylose, glucose, glucuronic acid and α-/β-types glycosidic linkages as characterized by one-/two-dimensions nuclear magnetic resonance (NMR) experiments. Fractionation of the Ul-SPs by DEAE-cellulose chromatography yielded Ul-SP1 and Ul-SP2 (0.50 and 0.75 M NaCl, respectively) showing sulfation (15.72-18.04%) and total sugars (59.73-60.58%) consistent with the charge density pattern by combination of agarose/polyacrylamide gel eletrophoresis using sequential staining with toluidine blue and stains-all, although with slight differences in their sizes (40 and >100 kDa, respectively). By both activated partial thromboplastin time (APTT) and prothrombin time (PT) tests, anticoagulation of the fractions was virtually detected by APTT (0.39 and 0.43 IU, respectively) against heparin (193 IU). Fractions acted differently on both intrinsic/extrinsic pathways in TG using 60-fold diluted human plasma, with 50% efficacies up to 8.3 μg, whereas at high concentrations suggested intrinsic hypercoagulability since heparin abolished both systems at low amounts. Ul-SPs block TG, but predicting thrombosis in increasing doses.

Clorofícea Ulva lactuca possui polissacarídeos sulfatados (Ul-PSs) importantes biotecnologicamente, porém são desconhecidos seus potenciais sobre geração de trombina (GT). Analisaram-se as características estruturais e físico-químicas dos Ul-PSs como moduladores de GT. Digestão proteolítica rendeu (13,13%) extrato contendo sulfato (20,43%) e açúcares totais (65,72%), além de ulvana, como caracterizada por experimentos de ressonância magnética nuclear uni-/bi-dimensionais, consistindo de ramnose, xilose, glucose, ácido glucurônico e ligações glicosídicas tipos-α/-β. Fracionamento dos Ul-PSs por cromatografia de DEAE-celulose rendeu Ul-PS1 e Ul-PS2 (0,50 e 0,75 M de NaCl, respectivamente) mostrando sulfatação (15,72-18,04%) e açúcares totais (59,73- 60,58%) consistentes com o grau de densidade de carga por combinação de eletroforese em gel de agarose/poliacrilamida usando coramento sequencial com azul de toluidina e "stains-all", embora com diferenças quanto aos seus tamanhos (40 e >100 kDa, respectivamente). Por ambos os testes do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) e do tempo de protrombina, anticoagulação das frações foi detectada virtualmente pelo TTPA (0,39 e 0,43 UI, respectivamente) frente heparina (193 UI). Frações atuaram diferentemente sobre ambas as vias intrínsica/extrínsica na GT usando plasma humano diluído 60 vezes, com eficácias de 50% até 8,3 μg, enquanto em concentrações maiores sugeriram hipercoagulabilidade intrínsica visto que heparina aboliu ambos os sistemas em quantidades baixas. Ul-PSs bloqueiam GT, porém prevendo trombose em doses crescentes.

In vitro inactivation of thrombin generation by polysulfated fractions isolated from the tropical coenocytic green seaweed Caulerpa racemosa (Caulerpaceae, Bryopsidales) / Inativação in vitro da geração de trombina por frações polissulfatadas isoladas da macroalga verde cenocítica tropical Caulerpa racemosa (Caulerpaceae; Bryopsidales)

Pharmacological efficacy of Caulerpa racemosa (Chlorophyta) sulfated polysaccharidic (SPs) fractions (F I→III) on models of coagulation and inflammation has been demonstrated, but not their effects on thrombin generation (TG). This study examined fractions for composition and physical-chemical characteristics and in vitro inactivation of TG by F I and F II in 60-fold diluted human plasma using continuous method. Papain-extraction yield of 0.7% revealed F I→III by DEAE-cellulose chromatography, with differences among the relative proportions of sulfate (17.37-24.00%), total sugars (30.03-48.34%) and absence of proteins. Charge density patterns and molecular sizes > 100 kDa of the fractions were verified by both agarose/polyacrylamide analyses, respectively. These electrophoreses combined with toluidine blue/Stains-All also indicated nonSPs. Anticoagulant effects of 4.76 (F I), 12.00 (F II) and 2.32 (F II) IU mg-1 by activated partial thromboplastin time test were recorded against heparin (193 IU mg-1), without changes in prothrombin time. Diluted plasma treated with F I and F II reduced concentration-dependent and sulfation pattern TG by both intrinsic and extrinsic pathways, with 50% inactivation by intrinsic pathway of F II even at 4.1 µg. Heparin abolished TG at least 4-fold lower. Therefore, C. racemosa produces SPs with TG inhibition.

Eficácia farmacológica de frações (F I→III) polissacarídicas sulfatadas (PSs) da Chlorophyta Caulerpa racemosa sobre modelos de coagulação e inflamação tem sido demonstrada, exceto seus efeitos sobre geração de trombina (GT). Examinaram-se frações quanto à composição, características físico-químicas e inativação in vitro de GT por F I e F II, em plasma humano diluído 60 vezes usando método contínuo. Rendimento de extração-papaína (0,7%) revelou, por cromatografia de DEAE -celulose, F I→III com diferenças entre as proporções relativas de sulfato (17,37-24,00%), açúcares totais (30,03-48,34%) e ausência de proteínas. Foram verificados, por ambas as análises agarose/poliacrilamida, graus de densidade de carga e tamanhos moleculares > 100 kDa das frações, respectivamente. Também essas eletroforeses, combinadas com azul de toluidina/Stains-All, indicaram polissacarídeos não sulfatados. Foram registrados, pelo teste do tempo de tromboplastina parcial ativada, efeitos anticoagulantes de 4,76 (F I), 12,00 (F II) e 2,32 (F II) UI mg-1 contra heparina (193 UI mg- 1), porém não modificando tempo de protrombina. Plasma diluído tratado com F I e F II reduziu GT por ambas as vias intrinsíca/extrínsica, dependente de concentração e grau de sulfatação, com F II em 4,1 µg apresentando eficácia de 50% pela via intrínsica. Heparina, quatro vezes menos, aboliu GT. Portanto, C. racemosa produz PSs com inibição de GT.