Verification of the linear range and the minimum detection limit in real-time fluorescence quantitative PCR for HBV DNA / 国际检验医学杂志

Objective Use real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(PCR)to determine HBV DNA,then calculate the linear range and the minimum detection limit,which are the main performance indicators in the laboratory verification. Methods According to the related documents,by serial dilution of high concentration samples,samples of serial concentrations were obtained which were out of the linear range mentioned in the instructions,then verifid the new linear range.By serial dilution of low concentration,samples were obtained,the concentrations of which were lower than the minimum detection limit of provide by the manufacturer,then the new minimum detection limit was verified.Results The linear range of HBV DNA detection was 8.58× 102 -8.41×107 IU/mL,and the minimum detection limit of HBV DNA detection was 4.07 ×102 IU/mL.Conclusion The linear range and the minimum detection limit of Real-time fluorescence quantitative PCR assessed reaches the expected requirement,and the method and validation scheme are simple and feasible.

Determinação do limite mínimo de detecção da técnica de Nested-PCR para os poliomavírus JC e BK / Assessment of minimum detection limit of Nested-PCR for JC and BK polyomaviruses

Introduction: Polyomaviruses (BKV and JCV) cause infection mainly in immunocompromised adults. A sensitive and specific diagnosis tool is fundamental to demonstrate the BKV and JCV infections. Nowadays many laboratories are using a PCR technique for detecting polyomaviruses genome in clinical samples. In this context, the purpose of this study is to determine the threshold of detection of the nested-PCR for polyomaviruses JC and BK. Methods: Serial dilutions of the samples of BKV and JCV of known concentration (100 copies/mL, 50 copies/mL, 25 copies/mL, 10 copies/mL, 5 copies/mL, and 1 copy/ml) were subjected to the technique of nested-PCR. All dilutions were tested 11 times to determine the minimum detection limit. Results: The minimum detection limit of the nested-PCR for JC and BK viruses was 25 copies/mL. This dilution (25 copies/mL) showed 100% PCR positive reaction. Furthermore, we found that weak positive results were obtained at dilutions of 1,5 and 10 copies/mL in some repetitions. Dilutions of 25, 50, and 100 copies/mL always had very positive results. Conclusions: These values are similar to those reported in other studies, contributing to the indication of this PCR for potential diagnostic purposes.

Introdução: Os poliomavírus (JCV e BKV) causam infecções principalmente em adultos imunocomprometidos. Um diagnóstico sensível e específico é de fundamental importância para os pacientes portadores de JCV e BKV. Atualmente alguns laboratórios têm utilizado a técnica de PCR para a detecção do material genético destes vírus em amostras clínicas. Assim, o objetivo deste estudo é determinar o limite mínimo de detecção da técnica de nested-PCR para os poliomavírus JC e BK. Métodos: Diluições seriadas (100 cópias/mL; 50 cópias/mL; 25 cópias/mL; 10 cópias/mL; 5 cópias/mL e 1 cópia/mL) de controles positivos comerciais de JCV e BKV com concentrações conhecidas foram submetidas à técnica de nested-PCR semi-duplex. Todas as diluições foram testadas 11 vezes para determinação do limite mínimo de detecção. Resultados: O limite mínimo de detecção da reação de nested-PCR para os vírus JC e BK foi de 25 cópias/mL para ambos, com 100% de positividade das diluições testadas na reação de PCR. Ainda, pudemos observar que resultados positivos fracos foram obtidos nas diluições de 1, 5 e 10 cópias/mL em algumas das repetições realizadas. As diluições de 25, 50 e 100 cópias/mL sempre obtiveram resultado rancamente positivo. Conclusões: Estes valores são semelhantes aos relatados em outros estudos, contribuindo para a indicação desta reação de PCR para potenciais fins diagnósticos.

Determinação do limite mínimo de detecção da técnica de PCR “nested” para o vírus da hepatite B (HBV) / Evaluation of minimum detection limit to hepatitis B virus (HBV) PCR “nested”

Mundialmente, a hepatite pelo vírus B (HBV) é considerada um dos maiores problemas de saúde pública, apesar da vacinação. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que mais de 2 bilhões de pessoas estejam infectadas pelo HBV. O Brasil é classificado como área de incidência intermediária pela OMS. No entanto, estudos de prevalência detectaram diferenças de índices de infecção nas regiões geográficas: 8% na região Amazônica, 2,5% nas regiões Centro-Oeste e Nordeste, 2% na Sudeste e 1% na região Sul. Um diagnóstico sensível e específico é de fundamental importância para os pacientes portadores do HBV. O objetivo deste estudo foi determinar o limite mínimo de detecção da técnica de PCR “nested” “in house” para o HBV. Diluições seriadas de uma amostra quantificada de HBV (1000 cópias/mL; 750 cópias/mL; 500 cópias/mL; 250 cópias/mL) foram submetidas à técnica de PCR “nested”. O alvo da amplificação por PCR foi a região do core e pré-core do vírus. Para extração dos ácidos nucléicos da amostra foi empregado o kit comercial QIAmp. O limite mínimo de detecção encontrado foi de 500 cópias/mL ou 10 cópias por reação de PCR.

All over the world, the hepatitis B virus (HBV) is considered one of the major problems of public health, despite vaccination. World Health Organization (WHO) estimates that more than 2 billions of persons are infected by HBV. Brazil is classified as an area of intermediary incidence by WHO. However, prevalence studies have detected differences of infection indexes in geographic regions: 8% in the Amazonian region, 2,5% in middle-west and Northeast, 2% in Southeast and 1% in South. A sensitive and specific diagnosis is very important to the HBV carrier patients. The aim of this study was to determine the minimum limit of detection of the nested PCR in house technique for HBV. Serial dilutions of one quantified sample of HBV (1000 copies/mL; 750 copies/mL; 500 copies/mL; 250 copies/mL) were submitted to a nested PCR. The target of PCR was viral core and pre-core region. Commercial kit, QiAmp, was employed to purify nucleic acids from the sample. The minimum detection limit found was 500 copies/mL or 10 copies per PCR reaction.