Experimental infection by Anaplasma marginale in buffaloes and cattle: clinical, hematological, molecular and pathological aspects / Infecção experimental de Anaplasma marginale em búfalos e bovinos: aspectos clínicos, hematológicos, moleculares e patológicos

The study aimed to evaluate and compare the clinical, laboratory and pathological aspects of buffalo and bovine experimentally infected with AmRio 2 strain of Anaplasma marginale. Four Murrah buffaloes and four crossbred cattle were used in the experiment, which two animals of each species were splenectomized. Strain AmRio 2 of A. marginale was inoculated in all experimental animals. Clinical exams, Packed Cell Volume (PCV), blood counts, blood smears, rickettsemia, necropsy and histopathology were performed in all cases. Semi-Nested-PCR (snPCR) for the msp5 and snPCR for the msp1α target gene for identification of A. marginale in blood samples from animals was done. From positive samples for msp1α snPCR, samples were analyzed for the amino acid sequences of this gene. Two splenectomized cattle presented apathy, pale mucous membranes, jaundice, hyperthermia, and severe anemia. The remaining experimental animals did not show clinical signs. The rickettsemia in all animals was less than 1%. The mean PCV of the splenectomized cattle was below 20% at two-time points after infection. On the blood count, the main changes were observed in splenectomized calves and were characterized by a decrease in red blood cells, hemoglobin, PCV and platelets (p <0.05). All animals presented leukocyte elevation by increased lymphocytes, however, with no significant difference. The average prepatent period was two days in all the animals. The average incubation period in cattle that became ill was 25.5 days, and death occurred, on average, 63 days after inoculation of the strain. The necropsy findings were characterized by pale carcass, ascites, enlarged liver, distended gallbladder, and thick bile. Histopathological findings included infiltration of macrophages and lymphocytes in various organs, hepatic sinusoidal dilatation, and necrosis of the large intestine. In snPCR for the msp5 gene, 100% of the animals were positive in at least one evaluation. And in the snPCR for the infection of the msp1α target gene was also found in all animals in at least one sample evaluated. However, sequencing revealed only five animals, including the bovine which died, with a similarity of the amino acid sequences with AmRio 2 strain of A. marginale. It is concluded that the splenectomized cattle died due to anaplasmosis caused by the inoculated strain and the buffalo were more resistant compared to cattle. Buffaloes can be an alternative to cattle rearing in areas with a high occurrence of clinical cases of anaplasmosis.(AU)

O estudo teve como objetivo avaliar e comparar os aspectos clínicos, laboratoriais e patológicos de búfalos e bovinos infectados experimentalmente com estirpe AmRio 2 de Anaplasma marginale. Para isso, foram utilizados quatro bubalinos Murrah e quatro bovinos mestiços, sendo dois animais de cada espécie, esplenectomizados. Estirpe AmRio 2 de A. marginale foi inoculada em todos os animais. Foram realizados exames clínicos, hematócrito, hemograma, esfregaço sanguíneo com avaliação de riquetsemia, necropsia e histopatologia, além de, Semi-Nested-PCR (snPCR) para o gene alvo msp5 e snPCR para o gene alvo msp1α para identificação de A. marginale nas amostras de sangue dos ruminantes. A partir das amostras positivas na snPCR msp1α, foram selecionadas amostras para análise das sequências de aminoácidos deste gene. Dois bovinos esplenectomizados apresentaram apatia, mucosas pálidas, icterícia, hipertermia e anemia severa. O restante dos animais não apresentou sintomatologia clínica. A riquetsemia em todos os animais foi menor que 1%. A média do hematócrito dos bovinos esplenectomizados esteve abaixo de 20% em dois momentos após infecção. Ao hemograma, as principais alterações observadas foram nos bovinos esplenectomizados e caracterizaram-se por redução de hemácias, hemoglobina, hematócrito e plaquetas (p<0,05). Todos os animais apresentaram elevação de leucócitos por aumento de linfócitos, porém, sem diferença significativa. O período pré-patente médio foi de dois dias em todos os animais. O período de incubação médio nos bovinos que adoeceram foi de 25,5 dias e estes morreram em média 63 dias após inoculação da estirpe. Os achados de necropsia caracterizaram-se por carcaça pálida, ascite, aumento de volume do fígado, vesícula biliar distendida e bile espessa. À histopatologia, verificou-se infiltração de macrófagos e linfócitos em diversos órgãos, dilatação dos sinusoides hepáticos e necrose do intestino grosso. A snPCR para o gene msp5, revelou 100% dos animais positivos em pelo menos um momento de avaliação. E na snPCR para o gene alvo msp1α também verificou-se infecção em todos os animais em pelo menos uma amostra avaliada. Entretanto, o sequenciamento revelou apenas cinco animais, incluindo os bovinos que morreram, com similaridade das sequências de aminoácidos com estirpe AmRio 2 de A. marginale. Conclui-se que os bovinos esplenectomizados morreram em virtude de anaplasmose provocada pela estirpe inoculada e os bubalinos foram mais resistentes em comparação aos bovinos. Finalmente, os búfalos podem ser uma alternativa à criação de bovinos em áreas com alta ocorrência de casos clínicos de anaplasmose.(AU)

Phylogeography of msp4 genotypes of Anaplasma marginale in beef cattle from the Brazilian Pantanal / Filogeografia de genótipos msp4 de Anaplasma marginale em gado de corte no Pantanal brasileiro

Abstract The msp4 gene of A. marginale is unicodon, stable and mostly homogeneous, being considered as a useful marker for phylogeographic characterization of this bacterium. The objective of this work was to analyze the phylogeography of A. marginale based on the msp4 gene in beef cattle from the Brazilian Pantanal, compared to those found in other regions worldwide. The blood samples investigated were collected from 400 animals (200 cows and 200 calves) reared in five extensive breeding farms in this region. The results indicated that of the evaluated samples, 56.75% (227/400) were positive for A. marginale based on the msp1β gene by quantitatitve PCR (qPCR), while 8.37% (19/227) were positive for the msp4 gene in the conventional PCR. In the Network distance analysis, 14 sequences from the Brazilian Pantanal were grouped into a single group with those from Thailand, India, Spain, Colombia, Parana (Brazil), Mexico, Portugal, Argentina, China, Venezuela, Australia, Italy and Minas Gerais (Brazil). Among 68 sequences from Brazil and the world, 15 genotypes were present while genotype number one (#1) was the most distributed worldwide. Both Splitstree and network analyses showed that the A. marginale msp4 sequences detected in beef cattle from the Brazilian Pantanal showed low polymorphism, with the formation of one genogroup phylogenetically related to those found in ruminants from South and Central America, Europe, and Asia.

Resumo O gene msp4 de A. marginale é unicodon, estável e pouco heterogêneo, sendo considerado como um marcador útil para caracterização filogeográfica desta bactéria. Este trabalho teve como objetivo analisar a filogeografia de A. marginale com base no gene msp4 em bovinos de corte do Pantanal Brasileiro, comparativamente a outra regiões do mundo. Alíquotas de sangue foram colhidas de 400 bovinos (200 vacas e 200 bezerros) em cinco propriedades de cria e recria extensiva. Como resultado, 56,75% (227/400) mostraram-se positivas para A. marginale pela qPCR para o gene msp1β e destas, 8,37% (19/227) amostras foram positivas na PCR convencional para o gene msp4. Na análise de distância Network, 14 sequências do Pantanal brasileiro foram agrupadas em um único grupo com as da Thailândia, Índia, Espanha, Colômbia, Paraná (Brasil), México, Portugal, Argentina, China, Venezuela, Austrália, Italia e Minas Gerais (Brasil). Dentre 68 sequências do Brasil e do mundo, constatou-se a presença de 15 genótipos, sendo o genótipo número um (#1) o mais distribuído. As sequências msp4 de A. marginale detectadas em bovinos de corte no Pantanal brasileiro apresentaram baixo polimorfismo com formação de dois genogrupos filogeneticamente relacionados àqueles encontrados em ruminantes de países das América do Sul e Central, Europa e Ásia.

Enzootic instability for bovine anaplasmosis on family farms located in southwestern Paraná, Brazil / Instabilidade enzoótica para anaplasmose bovina em propriedades de agricultura familiar do sudoeste paranaense, Brasil

Abstract The objective of this study was to assess the occurence of animals seropositive for Anaplasma marginale in the municipality of Realeza, Paraná State, Brazil. Blood samples were collected from 344 cows on 18 small farms in the municipality of Realeza-PR. The animals’serum samples were forwarded to the Federal University of Fronteira do Sul, in order to investigate the occurrence of anti-A. marginale IgG antibodies by an enzyme-linked immunosorbent assay commercial kit. IgG antibodies to A. marginale were detected in cattle from 77.7% of the farms. To the best author's knowledge, this is the first report of occurrence of A. marginale in cattle in southwestern Paraná. The serological assay showed that 24.4% of the animals were seropositive, thus characterizing the location investigated as an area of enzootic instability for the disease. The family farms located in the municipality of Realeza-PR showed enzootic instability for bovine anaplasmosis. It is necessary to conduct disease monitoring programs in association with preventive measures in order to ensure the sanitary quality of the herds and to reduce economic losses for the farmers. In addition, it is essential to implement educational extension actions that allow farmers to acquire knowledge, attitudes and perceptions regarding the risk factors that contribute towards herd A. marginale-infection.

Resumo O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência de animais soropositivos para Anaplasma marginale, no município de Realeza, Estado do Paraná, Brasil. Foram colhidas amostras de sangue de 344 fêmeas bovinas provenientes de 18 propriedades rurais do município de Realeza - PR. Amostras de soro dos animais foram encaminhadas à Universidade Federal da Fronteira Sul, para realização do Ensaio Imunoenzimático Indireto para pesquisa de anticorpos IgG anti- Anaplasma marginale por meio de kit comercial. Anticorpos IG anti-A. marginale foram detectados em 77,7% das propriedades. Trata-se do primeiro registro da ocorrência de A. marginale no Sudoeste paranaense. A sorologia evidenciou 24,4% de animais soropositivos, caracterizando o local pesquisado como área de instabilidade enzoótica para a doença. As propriedades de agricultura familiar, localizadas no município de Realeza-PR, apresentaram instabilidade enzoótica para anaplasmose bovina. É necessário que programas de monitoramento da enfermidade sejam realizados em conjunto com medidas de prevenção, visando garantir qualidade sanitária do rebanho e reduzir perdas econômicas dos produtores rurais. Além disso, é fundamental a realização de ações de extensão que viabilizem a aquisição de conhecimento, atitude e percepção dos criadores diante dos fatores de risco contribuintes para a infecção por A. marginale do rebanho.

Detecção sorológica e molecular de Anaplasma marginale em búfalos na Ilha de Marajó, Pará / Serological and molecular detection of Anaplasma marginale in water buffaloes on Marajó Island, State of Pará, Brazil

O objetivo do estudo foi testar a prevalência sorológica e molecular de Anaplasma marginale em búfalos do municipio de Soure, Ilha de Marajó, estado do Pará, Brasil. Para a pesquisa sorologica foram selecionados randomicamente 800 animais e para a pesquisa molecular 50 destes animais foram aleatoriamente escolhidos. Para quantificar a prevalência sorológica utilizou-se o ensaio de imunoadsorção enzimático indireto (iELISA) com antígeno total contendo proteínas de superfície externa e para quantificar a prevalência molecular utilizou-se a reação em cadeia da polimerase (PCR), envolvendo a amplificação de fragmento gênico da proteína de superfície maior 5 (MSP5). A prevalência de animais positivos no ELISA para A. marginale foi de 25% (200/800). Na PCR foi detectada a presença de A. marginale em 2% (1/50) dos animais. Embora apenas um animal tenha sido positivo na PCR, observou-se que o mesmo foi negativo no ELISA. A presença do agente, mesmo em baixa prevalência, mostra que os bubalinos podem funcionar como um importante reservatório desse patógeno para os rebanhos bovinos da região norte do Brasil.

The aim of the study was to test the molecular and serological prevalence of Anaplasma marginale in water buffaloes of the Marajó Island, State of Pará, Brazil. For serologic research were randomly selected 800 buffaloes and for molecular research 50 of these animals were randomly chosen. To quantify the serological prevalence we used the indirect enzyme linked immunosorbent assay (iELISA) with total antigen containing proteins outer surface. To quantify the prevalence molecular was used the polymerase chain reaction (PCR) involving gene amplification fragment larger surface protein 5 (MSP5). The prevalence of positive animals in iELISA was 25% (200/800). In the PCR we detected the presence of A. marginale in 2% (1/50) of animals. Although only one animal was positive in PCR, we found that it was negative in ELISA. The presence of the agent, even in low prevalence, shows that buffaloes can act as an important reservoir for transmission of the pathogen to cattle in northern Brazil.

Diagnóstico molecular de Anaplasma marginale em bovinos: avaliação quantitativa de uma PCR em tempo real baseada no gene msp5 / Molecular diagnosis of Anaplasma marginale in cattle: quantitative evaluation of a real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) based on msp5 gene

The rickettsia Anaplasma marginale is considered the main agent of bovine anaplasmosis. Due the nonspecific clinical signs of the anaplasmosis, the diagnosis of infection depends of laboratory confirmation. In recent years, molecular diagnostic methods have been used to detect A. marginale in cattle. However, the existence of a large number of assays of different sensitivity and cost makes the choice of an appropriate test difficult. In the present study, a real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) based on the msp5 target gene was quantitatively assessed and compared to an end point PCR. Both reactions were subjected to sensitivity and specificity evaluation using plasmid DNA and samples from cattle experimentally infected with A. marginale. A comparative field trial of the tests was carried out using samples of cattle from a stable enzootic area for A. marginale. The real-time PCR showed a higher sensitivity than the end point PCR. This reaction (i.e. real-time PCR) was able to detect one copy of the msp5 gene in 100 ηg of plasmidial DNA, and more than 80% of its results were positive among experimentally infected animals seven days after infection. In addition, based on in silico analysis, the real-time PCR evaluated in the present study appears to be useful for the detection of A. ovis.

A riquétsia Anaplasma marginale é considerada o principal agente da anaplasmose bovina. Devido a não especificidade dos sinais clínicos, a confirmação da infecção nos animais depende de testes laboratoriais. Recentemente, métodos de diagnóstico molecular têm sido aplicados para detecção de A. marginale em bovinos. No entanto, a grande quantidade de testes com diferentes sensibilidade e custos tem dificultado a escolha do ensaio mais adequado. No presente estudo, uma PCR em tempo real baseada no gene msp5 foi avaliada quantitativamente e comparada a uma reação de PCR convencional. As reações foram submetidas à avaliação de sensibilidade e especificidade com DNA plasmidial e amostras provenientes de bovinos experimentalmente infectados por A. marginale. Uma avaliação comparativa a campo foi realizada entre os testes utilizando amostras provenientes de bovinos criados em uma região de estabilidade enzoótica para A. marginale. Embora os testes não tenham apresentado diferença estatisticamente significativa, a PCR em tempo real apresentou valor de sensibilidade maior do que a PCR convencional. A PCR em tempo real foi capaz de detectar uma cópia de msp5 em 100ng de DNA plasmidial, e mais de 80% de resultados positivos entre bovinos experimentalmente infectados apenas sete dias após infecção. Além disso, baseado em análise in silico, a PCR em tempo real avaliada aqui pode ser útil para detecção de Anaplasma ovis.

Detection of genetic diversity of Anaplasma marginale isolates in Minas Gerais, Brazil / Detecção de diversidade genética de isolados Anaplasma marginale em Minas Gerais, Brasil

Bovine anaplasmosis, caused by the tick-borne rickettsiaAnaplasma marginale, is endemic in tropical and subtropical regions of the world and results in economic losses in the cattle industry. Major surface proteins (MSPs) have been used as markers for the genetic characterization of A. marginale strains and demonstrate that many isolates may occur in a given geographic area. However, in Brazil, little is known about the genetic diversity of A. marginale isolates within individual herds. This study was designed to examine the genetic variation among A. marginale infecting calves in a farm in the south of Minas Gerais State, Brazil. Blood samples collected from 100 calves were used to prepare Giemsastained smears that were microscopically examined for the presence of A. marginale. From each blood sample, DNA was extracted and analyzed by a polymerase chain reaction (PCR), followed by sequencing to determine diversity among the isolates. Examination of blood smears showed that 48% of the calves were infected with A. marginale, while the real-time PCR detected 70.2% positivity. Congenital infections were found in four calves. The microsatellite and tandem repeat analyses showed high genetic diversity among the isolates.

A anaplasmose bovina, causada pela rickettsia Anaplasma marginale e transmitida por carrapatos, é endêmica em regiões tropicais e subtropicais no mundo e causa grandes perdas econômicas na indústria de bovinos. Proteínas principais de superfície (MSPs) foram usados como marcadores para a caracterização genética de amostras de A. marginale, demonstrando que diferentes isolados podem ocorrer numa certa região geográfica. Porém, no Brasil pouco se sabe sobre a variedade genética de isolados de A. marginale em rebanhos individuais. Este estudo teve como objetivo investigar a ocorrência de variação genética entre bezerros infectados com A. marginale numa fazenda do sul de Minas Gerais, Brasil. Amostras de sangue coletadas de 100 bezerros foram utilizadas para o preparo de esfregaços sanguíneos, corados pelo Giemsa, para detecção da infecção por A. marginale. Amostras de DNA extraídas de cada amostra foram analisadas através de PCR seguido de sequenciamento. O exame dos esfregaços demonstrou que 48% dos bezerros estavam infectados com A. marginale, enquanto que o PCR detectou 70,2% de positividade. Infecção congênita foi detectada em quatro bezerros. As análises de microsatélites e 'tandem repeats' comprovaram uma grande diversidade genética entre os isolados.

Real time polymerase chain reaction to diagnose Anaplasma marginale in cattle and deer (Ozotoceros bezoarticus leucogaster) of the Brazilian Pantanal / Reação da polimerase em cadeia tempo real para diagnóstico de Anaplasma marginale em bovino e veado campeiro do Pantanal brasileiro Ozotoceros bezoarticus leucogaster

Epizootiological study of Anaplasma marginale in regions that contain various reservoir hosts, co-existence of rickettsia pathogens, and common vectors is a complicated task. To achieve diagnosis of this rickettsia in cattle and campeiro deer of Brazilian Pantanal, a comparison was made between a real time polymerase chain reaction (RT-PCR) with intercalating Sybr Green fluorochrome and primers based on msp5 gene of A. marginale; a conventional PCR (C-PCR); and parasitological examination using thin blood smear stained with Giemsa-MayGrunwald. Both PCRs showed good performance in the diagnosis of A. marginale in cattle, and were superior to the parasitological exam. The RT-PCR detected seven positive campeiro deer (16.3 percent). This rate was significantly higher compared to C-PCR, which identified one animal as positive (2.3 percent), and also compared to parasitological diagnosis, which did not find any positive animals. The dissociation temperature average of positive reactions in cattle (81.72 ºC ± 0.20) was identical to dissociation temperature found in the cervids (81.72 ºC ± 0.12), suggesting that both animal species were infected with A. marginale. We concluded that RT-PCR can be used for A. marginale diagnosis and in epizootiological studies of cattle and cervids; in spite of the small number of campeiro deer samples, the results indicated that this wildlife species has importance in the Anaplasma epizootiology in the Brazilian Pantanal.

O estudo epizootiológico de Anaplasma marginale em regiões que existem vários reservatórios, co-existência de espécies de riquétsias patógenas e vetores comuns é uma tarefa complicada. Com o objetivo de obter o diagnóstico dessa riquétsia em bovinos e veado campeiro do Pantanal brasileiro foi avaliada uma reação da polimerase em cadeia em tempo real (PCR-TR) com o fluoróforo intercalante de fita dupla de DNA Sybr Green e iniciadores baseados na seqüência do gene msp5 de A. marginale comparando-a a uma PCR convencional (PCR-C) e ao exame parasitológico de esfregaço fino de sangue corado com Giemsa-MayGrunwald. Ambas PCRs apresentaram bom desempenho no diagnóstico de A. marginale nos bovinos, o qual foi superior ao exame parasitológico. O PCR-TR detectou sete veados campeiros positivos (16,3 por cento), o que foi significativamente maior comparado ao PCR-C identificando um animal como positivo (2,3 por cento), e ao exame parasitológico não encontrou nenhum animal positivo. A média da temperatura de dissociação das reações positivas para amostras de bovinos (81,72 ºC ± 0,20) foi idêntica àquelas dos cervídeos ( 81,72 ºC ± 0,12), o que sugere que ambas espécies animais foram infectadas por A. marginale. Concluímos que PCR-TR pode ser utilizada para diagnóstico e estudos epizootiológicos de A. marginale em bovinos e cervídeos. Apesar da pequena amostragem de veado campeiro os resultados indicam que essa espécie de animal selvagem tem importância na epizootiologia do Anaplasma no Pantanal brasileiro.

Anaplasma marginale infection in cattle from south-western Amazonia / Infecção por Anaplasma marginale em bovinos na Amazônia Sul Ocidental, Brasil

The present study provides the first epidemiological data regarding infection by Anaplasma marginale in cattle reared in south-western Brazilian Amazonia. One simple procedure was adapted for the extraction of DNA from blood clots collected in seven microregions of Rondônia State and two mesoregions of Acre State. PCR method was used to asses the frequency of A. marginale infections in 4 to12-month-old cattle. The cattle infection was investigated by polymerase chain reaction (PCR) using the specific primer "msp5" for A. marginale. The DNA amplifications revealed that the mean frequency of A. marginale infection was 98.6 percent (1,627/1,650) in samples from Rondonia, and 92.87 percent (208/225) in samples from Acre. The high frequency of A. marginale infections in 4 to 12-month-old cattle indicate a situation of enzootic stability in the studied areas and are comparable to those detected by immunodiagnosis in different endemic regions in Brazil. The DNA extraction of clotted blood method described here can be used for epidemiological studies on anaplasmosis and other bovine hemoparasites.

O presente estudo fornece os primeiros dados epidemiológicos relativos a infecção por Anaplasma marginale em bovinos criados na Amazônia Sul Ocidental brasileira. Foi adaptado um procedimento simples para a extração de DNA a partir de coágulos sanguíneos coletados em sete microrregiões do estado de Rondônia e duas mesoregiões do estado do Acre. A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) foi aplicada para avaliar a freqüência da infecção por A. marginale em bovinos com idade entre 4 e 12 meses. Após a extração do DNA de cada amostra, a infecção nos bovinos foi investigada pela amplificação do gene "msp5" de A. marginale. As técnicas de amplificação do DNA revelaram que a freqüência de infecção por A. marginale foi de 98,6 por cento (1.627/1.650) nas amostras provenientes de Rondônia e de 92,87 por cento (208/225) nas amostras do Acre. A alta freqüência da infecção por A. marginale nos animais com idade entre 4 e 12 meses indica uma situação de estabilidade enzoótica nas regiões estudadas, as quais são comparáveis às detectadas por técnicas de imunodiagnóstico em outras regiões endêmicas no Brasil. A extração do DNA através do método aqui descrito pode ser utilizado em estudos epidemiológicos sobre a anaplasmose bovina e outros hemoparasitas.

Comparação entre diversos antígenos para o diagnóstico de Anaplasma marginale por ELISA / Comparison between several antigens for diagnosis of Anaplasma marginale by ELISA

Anaplasmose bovina é uma doença com grande importância nas regiões tropicais e subtropicais do mundo por determinar perdas econômicas devido à mortalidade e redução da produtividade. É causada por Anaplasma marginale, uma riquétsia intraeritrocítica obrigatória cujo controle requer, além de uma vacina eficiente, uma acurada identificação de bovinos cronicamente infectados. Apesar de existirem atualmente diversos métodos de diagnóstico dessa riquétsia, os métodos sorológicos, em particular o ensaio de imunoadsorção enzimática-ELISAs, são os mais utilizados devido à sua versatilidade e praticidade. No entanto, devido ao grande número de antígenos disponíveis, atualmente torna-se necessária uma avaliação para definir quais antígenos apresentam um melhor desempenho no diagnóstico da anaplasmose. Soros de bovinos positivos e negativos para A. marginale por PCR, e soros de animais provenientes do Brasil e Costa Rica, foram testados em ELISAs baseados em MSP1a, MSP2 e MSP5 recombinantes, um pool das três proteínas recombinantes, e antígeno de lisado de corpúsculos iniciais da riquétsia (CI). Utilizando soro de bovinos positivos para A. marginale por PCR, uma maior sensibilidade foi observada no ELISA CI. No entanto, uma maior especificidade, com soro de bovinos negativos a PCR, foi observada com os ELISAs recombinantes. O porcentual de bovinos positivos do Brasil e Costa Rica foi maior com ELISA CI. Razões para essas diferenças são discutidas.

Bovine anaplasmosis is a major disease in tropical and subtropical regions of the world by determine economical loss due mortality and productive reduction. The disease is caused by Anaplasma marginale, an intraerythrocytic rickettsia whose control requires, besides an efficient vaccine, the accurate identification of chronically infected cattle. Although the existence of diverse methods of diagnosis of this rickettsia, the serological methods, in particular the enzyme immunosorbent assays (ELISAs), are the most used due to its versatility and practice. However, due to the high number of antigens currently available, an evaluation becomes necessary to define which antigens present the better performance in the diagnosis of anaplasmosis. Sera from cattle positive or negative to A. marginale by PCR, and sera from cattle proceeding from Brazil and Costa Rica, were tested by ELISAs based in recombinant MSP1a, MSP2, and MSP5, a pool of the three recombinant proteins, and initial body lisate antigen (CI). Using sera from A. marginale positive cattle by PCR, the highest sensitivity was shown by CI ELISA. Nevertheless, the highest specificity, with sera from negative cattle by PCR, was shown by recombinants ELISAs. The percentiles of positive cattle from Brazil and Costa Rica were higher with CI ELISA. Reasons for such differences were discussed.

Characterization of recombinant MSP5 Anaplasma marginale Havana isolate

Anaplasma marginale is the causative agent of bovine anaplasmosis, a disease of worldwide economic importance. Major surface proteins (MSPs) are involved in host-pathogen and tick-pathogen interactions and they have been used as markers for the genetic characterization of A. marginale strains and phylogenetic studies. The major surface protein 5 (MSP5) is highly conserved in the genus Anaplasma and in all isolates of A. marginale. The aim of the present work was to carry out the cloning, sequencing and characterization of the recombinant MSP5 Anaplasma marginale Havana isolate. The sequence of the msp5 gene of Anaplasma marginale Havana isolate with a size of 633 pb was determined (Acc. No. AY527217). This gene was cloned into pRSETB vector and expressed in Escherichia coli. The MSP5 protein was recognized by the monoclonal antibody ANAF16C1 and it showed a high similitude percent with the gene sequence described for other Anaplasma marginale isolates. These data are very important for the development of a diagnostic test for A. marginale using the MSP5 recombinant protein.

Cloning, sequencing and antigenic characterization of rVirB9 of Anaplasma marginale isolated from Paraná State, Brazil

Anaplasma marginale, a tick-borne bacterium, causes bovine anaplasmosis responsible for significant economic losses in tropical and subtropical regions worldwide. Various major outer membranes have been described, and VirB9, a type IV secretion system protein, has been recently indicated as a candidate in vaccine development against anaplasmosis. The virB9 gene of an A. marginale strain isolated in Paraná, Brazil, was cloned by polymerase chain reaction and sequenced; its cloning into the pETSUMO vector produced a virB9-SUMO-6x His fusion gene construct. This recombinant clone was over-expressed in Escherichia coli BL21 (DE3), and the expressed fusion protein was solubilized with urea and purified with an Ni-NTA column. This method produced a relatively high yield of rVirB9. The deduced amino acid sequence encoded by VirB9 showed 99% homology to A. marginale isolates from St. Maries. rVirB9 was recognized by serum from cattle immunized with PR1 strain and by bovine sera infected with heterologous strains, showing that rVirB9 has conserved epitopes, which suggests that rVirB9 could be useful for the development of a vaccine against anaplasmosis.

Transcrição de genes de proteínas de membrana de isolados brasileiros de Anaplasma marginale / Transcription of genes of membrane proteins of Brazilians isolates of Anaplasma marginale

Este trabalho demonstra o padrão de transcrição de genes de proteínas de membrana em três isolados brasileiros de A. marginale (Rio Grande do Norte, Pernambuco-Zona da Mata e Pernambuco-Sertão). O RNA foi purificado a partir de sangue de bovinos infectados experimentalmente com os três isolados de A. marginale. Após transcrição reversa, os genes omp1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14; opag1-3; virB3, 9, 10; am097, 197, 254, 854 e 956 foram amplificados por PCR, com oligonucleotídeos iniciadores específicos. Detectaram-se transcritos para todos os genes analisados, exceto omp2, 3 e opag3 em todos os isolados e do gene omp7 em um dos isolados estudados. A ausência de transcrito para os genes opag3 e omp7 diverge do observado em isolados americanos da riquétsia. Possíveis razões para essas diferenças são discutidas.

This work shows the transcription profile of membrane protein genes in three Brazilian isolates of Anaplasma marginale (Rio Grande do Norte, Pernambuco-Zona da Mata, and Pernambuco-Sertão). RNA was purified from cattle blood experimentally-infected with the three isolates of A. marginale. After reverse transcription, genes omp1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, and 14; opag1-3; virB3, 9, and 10; am097, 197, 254, 854, and 956 were amplified by PCR, with specific primers. Transcripts were detected for all genes, except omp2, 3 e opag3 in all isolates and for omp7 in one out of the three isolates analyzed. Absence of transcription for opag3 and omp7 diverge from the North American isolates of A. marginale. Reasons for such differences were discussed.

ELISA com MSP5 recombinante truncada para detecção de anticorpos contra Anaplasma marginale em bovinos / ELISA based on recombinant truncated MSP5 for detection of antibodies against Anaplasma marginale in cattle

Os objetivos deste estudo foram produzir e solubilizar a proteína MSP5 recombinante truncada de Anaplasma marginale, e avaliar seu desempenho em um ensaio de imunoadsorção enzimática indireto (ELISA) para detecção de anticorpos contra a riquétsia. O gene msp5, exceto a região N-terminal hidrofóbica, foi amplificado por PCR, clonado em plasmídeo pTrcHis-TOPO e expresso em Escherichia coli. A solubilização da proteína recombinante foi avaliada em diferentes pHs e concentrações de uréia. A sensibilidade e a especificidade do ensaio foram avaliados testando-se 66 soros de animais infectados experimentalmente com A. marginale e 96 soros negativos, com o estado de infecção destes animais confirmado por PCR. Um total de 1.666 amostras de soros bovino, provenientes do Brasil - Rio Grande do Sul (73), Mato Grosso do Sul (91), Pernambuco (86), Bahia (314) e Minas Gerais (267)-, Uruguai (32) e Costa Rica (803) foram testadas nos ELISAs com MSP5 truncada e com MSP1a recombinantes e a concordância entre os dois testes foi avaliada. O ELISA indireto com MSP5 truncada foi capaz de detectar animais infectados com 96,97 por cento de sensibilidade e 100 por cento de especificidade. Nos animais infectados experimentalmente, o ELISA detectou anticorpos do 12° até o último dia de observação (37° dia). Os ELISAs para MSP5 e MSP1a apresentaram concordância de 95,67 por cento, com índice kappa de 0,81. Os resultados discordantes apresentaram uma diferença significativa (p <0,001). Anticorpos contra A. marginale foram detectados em animais de todas as regiões estudadas. O ELISA com MSP5 recombinante truncada apresentou bom desempenho na detecção de anticorpos contra A. marginale, com alta sensibilidade e especificidade, representando uma importante ferramenta para o diagnóstico da anaplasmose bovina em estudos epidemiológicos.

The objective of this study was the production and solubilization of recombinant truncated MSP5 of Anaplasma marginale and the evaluation of its performance in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), to detect antibodies against the rickettsia in cattle. The fragment of msp5 gene, except the hydrophobic N-terminal region, was amplified by PCR, cloned in pTrcHis-TOPO plasmid and expressed in Escherichia coli. Solubilization of the recombinant protein was evaluated in different pHs and concentrations of urea. The sensibility and specificity of the assay were evaluated with 66 sera from cattle experimentally-infected and 96 sera from cattle free of A. marginale defined by polymerase chain reaction for msp5 gene. Serum samples from 1,666 cattle from Brazil - states of Rio Grande do Sul (73), Mato Grosso do Sul (91), Pernambuco (86), Bahia (314) and Minas Gerais (267), Uruguay (32) and Costa Rica (803), were tested by ELISAs with recombinant truncated MSP5 and with recombinant MSP1a, and the agreement between both ELISAs was calculated. ELISA with recombinant truncated MSP5 protein detected infected animals with sensibility of 96.97 percent and specificity of 100 percent. In cattle experimentally-infected, the ELISA detected antibodies from the 12th day post-infection (DPI) to the end of the experiment, at the 37th DPI. The agreement between the ELISAs with truncated MSP5 and MSP1a antigens was 95.67 percent, with a kappa index of 0.81. Disagreement results showed significative difference (p <0.001). Antibodies for A. marginale were detected in animals of the all the region analyzed. The ELISA with recombinant truncated MSP5 showed a good performance in ELISA for detention of antibodies against A. marginale, with high sensitivity and specificity, representing an important tool for the diagnosis of anaplasmose bovine in epidemiological studies.

Cloning, sequencing, expression, and antigenic characterization of rMSP4 from Anaplasma marginale isolated from Paraná State, Brazil

Anaplasmosis is a bovine intraerythrocytic disease caused by the bacterium Anaplasma marginale; it causes significant economic losses in tropical and subtropical regions, worldwide. The msp4 gene of an A. marginale strain isolated in Paraná, Brazil, was amplified by PCR and sequenced; its cloning into the pET102/D-TOPO® vector produced an msp4-6xHis-V5-HP thioredoxin fusion gene construct. This recombinantclone was over-expressed in Escherichia coli BL21(DE-3); the expressed fusion protein was found almost entirely in the insoluble form (inclusion bodies) in the cell lysate. The inclusion bodies were solubilized with urea and the recombinant protein was purified by Ni-NTA column and dialyzed. This method produced a relatively high yield of rMSP4, which was used to immunize rabbits. The deduced amino acid sequence encoded by MSP4 showed 99% homology to A. marginale isolates from Florida, USA, and from Minas Gerais, Brazil. Both rMSP4 and native MSP4 were recognized by post- immunization rabbit serum, showing that rMSP4 has conserved epitopes. As antigenicity was preserved, rMSP4 might be useful for the development of vaccine against anaplasmosis.

Tristeza parasitária bovina na região sul do Rio Grande do Sul: estudo retrospectivo de 1978-2005 / Tick fever in southern Brazil: a retrospective study of 1978-2005

Foi realizado um estudo retrospectivo dos casos de tristeza parasitária bovina (TPB) ocorridos no sul do Rio Grande do Sul, área de influência do Laboratório Regional de Diagnóstico (LRD) da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas entre 1978 e 2005. De um total de 4.884 materiais de bovinos provenientes de necropsias realizadas e órgãos ou sangue enviados ao laboratório 231 (4,7%) tiveram o diagnóstico de TPB. Desses 231 surtos foram resgatados os dados de 221 diagnósticos dos quais 91 (41,1%) foram causados por Babesia bovis, 11 (4,9%) por Babesia bigemina, e 65 (29,41%) por Anaplasma marginale. Em outros 33 (14,93%) surtos de babesiose não foi informada a espécie de Babesia e em 21 (9,5%) surtos foi detectada infecção mista por Babesia sp e A. marginale. Os índices gerais médios de morbidade, mortalidade e letalidade, resgatados em 149 dos 221 surtos da doença, foram de 11,17%, 6,81% e 70,04%, respectivamente. Verificou-se que, na região estudada, a maioria dos surtos ocorre durante os meses de verão e outono, e que os animais com um a três anos de idade são os mais afetados. Os sinais clínicos nos surtos caracterizaram-se por apatia, orelhas caídas, debilidade, febre, anorexia e emagrecimento. Os valores de hematócrito eram baixos. Hemoglobinúria foi frequentemente observada nos casos de babesiose. Sinais neurológicos estavam presentes nos casos de babesiose por B. bovis e se caracterizaram por transtornos da locomoção, tremores musculares, agressividade e quedas com movimentos de pedalagem. As lesões macroscópicas principais relatadas nos casos de babesiose foram esplenomegalia, hepatomegalia, fígado amarelo, hemoglobinúria, icterícia, hemorragias cardíacas e bile espessa. Congestão do córtex cerebral foi relatada nos casos de babesiose por B. bovis. Nesta região, com população de bovinos de aproximadamente 2.630.000 cabeças as perdas anuais por morte de bovinos pela enfermidade podem ser estimadas em 6.220 cabeças por ano...

A retrospective study of tick fever was made, which occurred from 1978-2005 in southern Rio Grande do Sul in the influence area of the Regional Diagnostic Laboratory of the Federal University of Pelotas. From 4,884 cattle specimens, sent by practitioners or which were from necropsies performed at the Diagnostic Laboratory, 231 (4.7%) were diagnosed as tick fever. Data from 221 of those outbreaks were analyzed. Ninety one (41.1%) outbreaks were caused by Babesia bovis, 11 (4.9%) by Babesia bigemina, and 65 (29.41%) by Anaplasma marginale. In other 33 (14.93%) outbreaks of babesiosis there is no information if the disease was caused by B. bovis or B. bigemina, and 21 (9.5%) outbreaks were caused by mixed infection of A. marginale and B. bovis or B. bigemina. Mean morbidity, mortality, and letality rates in 149 outbreaks were 11.17%, 6.81%, and 70.04%, respectively. Most outbreaks occurred during summer (January-March) and autumn (April-June), mainly in 1 to 3-year-old cattle. Clinical signs were depression, weakness, fallen ears, fever, and weight loss. Low packed cell volume values were always found. Hemoglobinury was observed in babesiosis. Neurological signs characterized by gait alterations, muscular tremors, aggressiveness and falling down with tonic and clonic convulsions were observed in babesiosis by B. bovis. The main gross lesions were anemia, jaundice, splenomegaly, hepatomegaly, yellow liver and cardiac hemorrhages. Hemoglobinury was observed in babesiosis, and congestion of the cerebral cortex in babesiosis by B. bovis. It is concluded that B. bovis is the main agent causing thick fever in southern Rio Grande do Sul. In that region with a cattle population of 2,630,000 heads the annual losses due to tick fever can be estimated in 6,220 cattle or US$ 1,623,000.00. Preventive measures to diminish tick fever losses in the region are necessary.