Morphological and molecular diagnosis of diseases of free-ranging crab-eating foxes (Cerdocyon thous) / [Diagnóstico morfológico e molecular de doenças de cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) de vida livre]

The aim of this study was to investigate the occurrence of diseases in free-ranging wild canids that were roadkill on highways in the State of Espírito Santo, Brazil. PCR tests were performed for the detection of Brucella sp., Babesia sp., Rangelia sp., and Hepatozoon sp. in the spleen. Morphological evaluation and identification of parasites was performed in the liver and lung. Twenty specimens of C. thous were necropsied at the Animal Pathology Sector of the Veterinary Hospital of the Universidade Federal do Espírito Santo. Tissue samples were processed for histopathological examination and polymerase chain reaction (PCR) analysis. There was no PCR amplification of genomic DNA sequences of Brucella sp., Babesia sp., Rangelia sp., and Hepatozoon sp. using DNA extracted from the spleen as template. Histologically, lesions associated with parasitism by Platynosomum sp. and Angiostrongylus sp. were observed in the liver and lung, respectively. This is the first report of Platynosomum sp. and Angiostrongylus sp. parasitism in C. thous in the state of Espírito Santo, Brazil. Therefore, this study demonstrated parasitism of crab-eating foxes by Platynosomum sp. and Angiostrongylus sp. Importantly, no evidence of infection with Brucella sp., Babesia sp., Rangelia sp., and Hepatozoon sp. was obtained by PCR analysis.(AU)

O objetivo deste estudo foi investigar a ocorrência de doenças em canídeos silvestres de vida livre que foram atropelados em rodovias no estado do Espírito Santo, Brasil. Testes de PCR foram realizados para a detecção de Brucella sp., Babesia sp., Rangelia sp. e Hepatozoon sp. no baço. A avaliação morfológica e a identificação de parasitas foram realizadaa no fígado e no pulmão. Vinte espécimes de C. thous foram necropsiados no Setor de Patologia Animal do Hospital Veterinário da Universidade Federal do Espírito Santo. Amostras de tecido foram processadas para exame histopatológico e análise de reação em cadeia da polimerase (PCR). Não houve amplificação por PCR das sequências de DNA genômico de Brucella sp., Babesia sp., Rangelia sp. e Hepatozoon sp. usando-se DNA extraído do baço como modelo. Histologicamente, lesões associadas ao parasitismo por Platynosomum sp. e Angiostrongylus sp. foram observadas no fígado e no pulmão, respectivamente. Este é o primeiro relato de Platynosomum sp. e Angiostrongylus sp. parasitismo em C. thous no estado do Espírito Santo, Brasil. Portanto, este estudo demonstrou parasitismo de cachorro-do-mato por Platynosomum sp. e Angiostrongylus sp. É importante detacar que não há evidências de infecção por Brucella sp., Babesia sp., Rangelia sp. e Hepatozoon sp. por análise de PCR.(AU)

Molecular detection of Cercopithifilaria bainae and other tick-borne pathogens in Rhipicephalus sanguineus s.l. isolated from dogs in Midwest Brazil / Detecção molecular de Cercopithifilaria bainae e outros patógenos transmitidos por carrapatos em Rhipicephalus sanguineus s.l. isolados de cães no Centro-Oeste do Brasil

Abstract The aim of the present study was to detect Cercopithifilaria bainae and other tick-borne pathogens and to perform molecular characterization of the tick Rhipicephalus sanguineus s.l. collected from dogs. Ticks (n = 432, including 8 larvae, 59 nymphs, and 365 adults) were sampled from domiciled dogs (n = 73) living in Campo Grande, Mato Grosso do Sul (Midwest Brazil). All ticks were morphologically identified as R. sanguineus. Genomic DNA was extracted in pools (three to five ticks per animal) and was used for definition of R. sanguineus haplotypes (based on 16S rRNA analysis) and pathogen identification (Cercopithifilaria sp., Ehrlichia canis, Anaplasma platys, Hepatozoon canis, Babesia vogeli and Rickettsia spp.). Rhipicephal us sanguineus specimens were identified as haplotypes A and B. DNA of Cercopithifilaria bainae (43.83%; 32/73), Ehrlichia canis (24.65%; 18/73), Anaplasma platys (19.17%; 14/73), and Hepatozoon canis (5.47%; 4/73) was detected. The identity of pathogens was confirmed by DNA sequence analysis. The present study confirms the presence of haplotypes A and B of R. sanguineus in the state of Mato Grosso do Sul and its importance as a vector of several pathogens of veterinary concern. Finally, this is the first report to identify C. bainae in ticks in the Midwestern region of Brazil.

Resumo O objetivo do presente estudo foi detectar Cercopithifilaria bainae e outros patógenos transmitidos por carrapatos e realizar a caracterização molecular do carrapato Rhipicephalus sanguineus s.l. coletado em cães. Carrapatos (n = 432, incluindo 8 larvas, 59 ninfas e 365 adultos) foram amostrados de cães domiciliados (n = 73) residentes no município de Campo Grande, Mato Grosso do Sul (centro-oeste do Brasil). Todos os carrapatos foram identificados morfologicamente como R. sanguineus. O DNA genômico foi extraído em pools (três a cinco carrapatos por animal), seguido pela definição de haplótipos (com base no gene 16S rRNA) e pela investigação de patógenos (Cercopithifilaria sp., Ehrlichia canis, Anaplasma platys, Hepatozoon canis, Babesia vogeli e Rickettsia spp.). Os espécimes coletados foram identificados como haplótipos A e B de R. sanguineus. Foram detectados DNA de Cercopithifilaria bainae (43,83%; 32/73), Ehrlichia canis (24,65%; 18/73), Anaplasma platys (19,17%; 14/73) e Hepatozoon canis (5,47%; 4/73). A identidade dos patógenos foi confirmada por análise de sequência de DNA. O presente estudo confirma a circulação dos haplótipos A e B de R. sanguineus no estado de Mato Grosso do Sul e sua importância como vetor de vários patógenos de interesse veterinário. Finalmente, este é o primeiro relato de C. bainae em carrapatos na região centro-oeste do Brasil.

Molecular survey of tick-borne pathogens in small mammals from Brazilian Amazonia / Levantamento molecular de patógenos transmitidos por carrapatos em pequenos mamíferos da Amazônia brasileira

Abstract Small non-volant mammals (marsupials and small rodents) were captured at three different timepoints from 23 forest fragments across three municipalities (Alta Floresta, Sinop and Cláudia) covering the Amazonian biome of the Mato Grosso State in Midwestern Brazil. The animal tissues (liver and spleen) and blood were screened using molecular tools for the detection of Babesia, Coxiella, Cytauxzoon, Hepatozoon, Theileria, and Anaplasmataceae agents. A total of 230 specimens (78 rodents and 152 marsupials) were trapped. Hepatozoon and Piroplasmorida agents were detected in the common opossums (Didelphis marsupialis). In turn, all samples (blood, liver, or spleen) collected from the small mammals were negative for the genus Coxiella and the family Anaplasmataceae, as detected by polymerase chain reaction (PCR). Phylogenetic analyses inferred from partial sequences of the 18S rRNA gene highlighted the occurrence of new Hepatozoon and Piroplasmorida haplotypes. Future studies determining the role of common opossum (D. marsupialis) in the epidemiological cycles of Hepatozoon and Babesia under natural conditions in the Amazonian biome are necessary.

Resumo Pequenos mamíferos não voadores (marsupiais e pequenos roedores) foram capturados em três diferentes períodos, ao longo de 23 fragmentos florestais de três municípios (Alta Floresta, Sinop e Cláudia), localizados no bioma amazônico do Estado de Mato Grosso, no centro-oeste do Brasil. Os tecidos dos animais (fígado e baço) e sangue foram selecionados e submetidos a ensaios moleculares para a detecção do DNA de Babesia, Coxiella, Cytauxzoon, Hepatozoon, Theileria e agentes Anaplasmataceae. Um total de 230 espécimes (78 roedores e 152 marsupiais) foram capturados. Hepatozoon e agentes Piroplasmorida foram detectados em gambás (Didelphis marsupialis). Ao contrário, todas as amostras (sangue, fígado ou baço) coletadas dos pequenos mamíferos foram negativas para o gênero Coxiella e a família Anaplasmataceae, conforme detectado pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Análises filogenéticas inferidas pelas sequências parciais do gene 18S rRNA evidenciaram a ocorrência de novos haplótipos de Hepatozoon e Piroplasmorida. Futuros estudos determinando a importância do gambá-comun (D. marsupialis) nos ciclos epidemiológicos de Hepatozoon e Babesia em condições naturais, no bioma amazônico, são necessários.

Molecular detection of vector-borne agents in cats in Southern Brazil / Detecção molecular de agentes transmitidos por vetores em felinos domésticos no Sul do Brasil

Abstract This study used serological and molecular methods to investigate the occurrence of vector-borne pathogens (VBP) with zoonotic potential in cats neutered at the University Veterinary Hospital in Canoinhas, Santa Catarina. The combined PCR and serological results revealed that 17 (56.6%) cats were positive for one or more pathogens. The sampled cats had antibodies to Ehrlichia spp. (7/30), Anaplasma phagocytophilum (3/30) and Leishmania infantum (2/30). The PCR assay detected DNA closely related to Ehrlichia canis in 6/30 cats, Mycoplasma haemofelis in 2/30 cats, A. phagocytophilum and Cytauxzoon sp. in one cat each. While Bartonella clarridgeiae and B. henselae were detected in two cats each, and B. koehlerae was detected in one cat.

Resumo Como os felinos podem ser parasitados por diversos patógenos transmitidos por vetores (PTV), alguns com caráter zoonótico, este estudo objetivou detectar por métodos sorológicos e moleculares, patógenos transmitidos por vetores hematófagos, em gatos atendidos em um Hospital Veterinário Universitário em Santa Catarina. Os resultados da PCR e da sorologia combinados, revelaram que 17 (56,6%) gatos foram positivos para um ou mais patógenos. Na sorologia, foram positivos 7/30 gatos para Ehrlichia, 3/30 para Anaplasma phagocytophilum e 2/30 para Leishmania infantum. Na PCR foi detectado DNA filogeneticamente associado a: Ehrlichia canis em 6/30 gatos; Mycoplasma haemofelis, em 2/30 gatos; A. phagocytophilum e Cytauxzoon sp. em 1/30 gatos cada. Enquanto Bartonella clarridgeiae e B. henselae foram detectadas, cada uma, em dois gatos, B. koehlerae foi detectada em um gato.

Hemoparasites in ticks of wild birds of Serra dos Órgãos National Park, state of Rio de Janeiro, Brazil / Hemoparasitos em carrapatos de aves silvestres do Parque Nacional da Serra dos Órgãos, estado do Rio de Janeiro, Brasil

Abstract The aim of this study is to detect the presence of tick-borne agents of genera Rickettsia, Borrelia, Babesia, Ehrlichia and Anaplasma in ticks collected from native wild birds in the state of Rio de Janeiro. Birds were captured and observed carefully to find the ectoparasites. DNA detection of hemoparasites was performed by means of the polymerase chain reaction (PCR). The sequences obtained were analyzed and their homologies were compared to the available isolates in the GenBank platform database. A total of 33 birds were captured from 20 different species, of which 14 were parasitized by Amblyomma longirostre (n = 22). There was absence of DNA from agents of the genera Babesia, Anaplasma and Ehrlichia in the evaluated samples. The phylogenetic analysis indicated that one sample had 100% identity with Rickettsia bellii (KJ534309), the other two samples showed 100% identity with Rickettsia sp. Aranha strain and strain AL (EU274654 and AY360216). The positive sample for R. bellii was also demonstrated to be positive for Borrelia sp., which presented a similarity of 91% with Borrelia turcica (KF422815). This is the first description of Borrelia sp. in ticks of the genus Amblyomma in South America.

Resumo Este trabalho teve como objetivo detectar evidências moleculares da presença de agentes dos gêneros Rickettsia, Borrelia, Babesia, Anaplasma e Ehrlichia transmitidos por carrapatos coletados de aves silvestres no estado do Rio de Janeiro. Aves foram capturadas e observadas cuidadosamente a procura de ectoparasitos. A detecção de DNA de hemoparasitos foi realizada por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). As sequências obtidas foram analisadas e sua homologia comparada aos isolados disponíveis na base de dados da plataforma GenBank. Foram capturadas 33 aves, de 20 espécies diferentes das quais 14 estavam parasitadas por Amblyomma longirostre (n = 22). Houve ausência de DNA de agentes dos gêneros Babesia, Anaplasma e Ehrlichia nas amostras avaliadas. A análise filogenética indicou que uma amostra apresentou 100% de identidade com Rickettsia bellii (KJ534309), as outras duas amostras apresentaram 100% de identidade com Rickettsia sp. cepa Aranha e Cepa AL (EU274654 e AY360216.). A amostra positiva para R. bellii também apresentou positividade para Borrelia sp. que apresentou similaridade de 91% com Borrelia turcica (KF422815). Esta é a primeira descrição de Borrelia sp. em carrapatos do gênero Amblyomma na América do Sul.

Genetic diversity of piroplasmids species in equids from island of São Luís, northeastern Brazil / Diversidade genética de espécies de piroplasmídeos em equídeos na ilha de São Luís, Nordeste do Brasil

Abstract Equine piroplasmosisis, a tick-borne disease caused by the intra-erythrocytic protozoans Babesia caballi and Theileria equi, has economic importance due to the international trade and the increased movement of horses all over the world. The goal of this study was to evaluate the occurrence of phylogenetic diversity of T. equi and B. caballi genotypes among infected equids from São Luís Island, state of Maranhão, northeastern Brazil. Between December of 2011 and June of 2012, EDTA-blood and serum samples were collected from 139 equids (90 donkeys, 39 horses and 10 mules). From 139 serum samples submitted to ELISA assay, IgG antibodies to T. equi and B. caballi were detected in 19.4% (27/139) and 25.2% (35/139), respectively. Among sampled animals, 21.6% (30/139) and 55.4% (77/139) were positive for cPCR assays for T. equi and B. caballi, based on ema-1 and rap-1 genes, respectively. Overall, the T. equi sequences (n=7) submitted to Maximum Likelihood analysis (based on a 18S rRNA fragment of 1700 bp after alignment) grouped into three main groups, which were subdivided in eight clusters. The present work showed that different genotypes of T. equi and B. caballi circulate among equids in Brazil.

Resumo A piroplasmose equina, uma doença transmitida por carrapatos e causada pelos protozoários intra-eritrocíticos Babesia caballi e Theileria equi, tem importância econômica devido ao comércio internacional e ao aumento do movimento de cavalos em todo o mundo. O objetivo do presente estudo foi mostrar a diversidade filogenética de T. equi e B. caballi infectando cavalos, burros e jumentos na Ilha de São Luís, Estado do Maranhão, Nordeste do Brasil. Entre dezembro de 2011 e junho de 2012, amostras de sangue com EDTA e soro de foram coletadas de 139 equídeos (90 jumentos, 39 cavalos e 10 burros). Dentre as 139 amostras de soro submetidas ao ensaio de ELISA, foram detectados anticorpos IgG contra T. equi e B. caballi em 19,4% (27/139) e 25,2% (35/139), respectivamente. Entre os animais amostrados, 21,6% (30/139) e 55,4% (77/139) foram positivos por meio dos ensaios de cPCR para T. equi e B. caballi, com base nos genes ema-1 e rap-1, respectivamente. No geral, as sequências T. equi (n = 7) submetidas à análise de Máxima Verossimilhança (baseada em um fragmento do 18S rRNA de 1700 pb, após o alinhamento) foram agrupadas em três grupos principais, os quais foram subdivididos em oito grupos. O presente trabalho mostrou que diferentes genótipos de T. equi e B. caballi circulam entre equídeos no Brasil.

Molecular epidemiology of Anaplasma platys, Ehrlichia canis and Babesia vogeli in stray dogs in Paraná, Brazil / Epidemiologia molecular de Anaplasma platys, Ehrlichia canis e Babesia vogeli em cães não domiciliados do Paraná

Hemoparasitic infections are tick-borne diseases, which affect animals and humans. Considering the importance of canine hemoparasitic infections in veterinary clinics, this study aimed to determine the occurrence of Anaplasma platys, Ehrlichia canis and Babesia vogeli in blood samples from 182 dogs not domiciled in the city of Pato Branco, southwestern region of Paraná State, Brazil, using polymerase chain reaction (PCR). The prevalence of A. platys and B. vogeli was 32.9% and 10.9% respectively, and A. platys infection prevailed (p<0.001). The number of dogs positive for A. platys was larger in Winter (p<0.05). All blood samples were negative for E. canis. In the dogs, infestation by Amblyomma cajennense predominated over that by Rhipicephalus sanguineus (p<0.001); but there was no significant association between PCR and the variables presence of ticks, sex and age. Dogs infected by A. platys and B. vogeli showed thrombocytopenia, lymphopenia and leukocytosis; but there was no correlation between such hematological changes and infection by hemoparasites. This appears to be the first molecular study that demonstrates the existence of A. platys and B. vogeli in dogs from the southwestern region of Paraná.(AU)

As hemoparasitoses são enfermidades transmitidas por carrapatos que afetam os animais e os humanos. Considerando a importância das hemoparasitoses caninas na clínica médica veterinária, este estudo objetivou determinar a ocorrência de Anaplasma platys, Ehrlichia canis e Babesia vogeli em amostras de sangue de 182 cães não domiciliados do município de Pato Branco, região sudoeste paranaense, Brasil, utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR). A prevalência de A. platys e B. vogeli foi de 32,9% e 10.9%, respectivamente, predominando a infecção por A. platys (p<0,001). Constatou-se um maior número de cães positivos para A. platys no período do inverno (p<0.05). Todas as amostras de sangue foram negativas para E. canis. Nos cães, a infestação por Amblyomma cajennense prevaleceu sobre a infestação por Rhipicephalus sanguineus (p<0,001), mas não foi observada associação significativa entre a PCR e as variáveis presença de carrapatos, sexo e idade. Cães infectados por A. platys e B. vogeli apresentaram trombocitopenia, linfopenia e leucocitose, porém não houve correlação destas alterações hematológicas com a infecção pelos hemoparasitas. Este é o primeiro estudo molecular que demonstra a existência de A. platys e de B. vogeli em cães da região sudoeste paranaense.(AU)

Detecção de Theileria equi e Babesia caballi e anticorpos anti-Ehrlichia spp. em equídeos do Pantanal Mato-Grossense, Brasil / Detection of Theileria equi, Babesia caballi and anti-Ehrlichia spp antibodies in equides from the Pantanal of Mato Grosso State

O presente estudo avaliou equídeos de 19 fazendas da região do Pantanal Mato-Grossense, sendo 121 equídeos testados pela reação em cadeia pela polimerase (PCR), para detectar fragmentos dos genes dos seguintes gêneros: Babesia, Theileria, Anaplasma, Ehrlichia, e Neorickettsia, e pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI), para detectar anticorpos anti-Ehrlichia spp. Das amostras testadas na PCR, 17 (14,0%) animais de nove (47,3%) fazendas foram positivos. Das amostras positivas, 16 foram 100% idênticas a sequencias de Theileria equi e uma foi 99% similar à sequência de Babesia caballi, todas disponíveis no GenBank. Pela RIFI, 48 (39,6%) equídeos foram soropositivos para antígenos de E. canis, sendo 40 (83,3%) amostras com títulos de 40 e oito (16,6%) com títulos de 320. Todas as fazendas avaliadas (100%) apresentaram equídeos soropositivos. Os resultados do presente estudo demonstram que T. equi e B. caballi infectam equinos na região, e a presença de anticorpos anti-Ehrlichia spp. indica a circulação de espécies antigenicamente relacionadas aos gêneros Ehrlichia e Anaplasma, apesar de a negatividade nos exames de PCR indicar provável processo crônico desses agentes.

The present study evaluated 121 equids from 19 ranches in the Pantanal region of Mato Grosso State through Polimerase Chain Raction (PCR) to detect Babesia, Theileria, Anaplasma, Ehrlichia and Neorickettsia partial genes and the Imunofluorescent Antibody Test (IFAT) to evaluate anti-Ehrlichia spp. antibodies. From the total tested in PCR, 17 (14.0%) equids from 9 (47.3%) farms were positive, and 16 yielded amplicons 100% identical to Theileria equi and one presented 99% similarity to Babesia caballi available on GenBank. Forty eight (39.6%) equids were positive by IFAT and 40 showed titers of 40 (83.3%) and 8 showed titers of 320 (16.6%). All ranches (100%) presented seropositive equids. Our results showed that T. equi and B. caballi are infecting equids in the region and the presence of anti-Ehrlichia antibodies suggests that species closely related to the genera Ehrlichia and Anaplasma are circulating among the equid local population. Moreover, the negative results in PCR is possibly related to the chronic infection phase.

Molecular and serological detection of tick-borne pathogens in dogs from an area endemic for Leishmania infantum in Mato Grosso do Sul, Brazil / Detecção sorológica e molecular de patógenos transmitidos por carrapatos em cães de uma área endêmica para Leishmania infantum do estado do Mato Grosso do Sul

Tick-borne pathogens affect a wide range of vertebrate hosts. To identify tick-borne pathogens among dogs from Campo Grande, MS, Brazil testing seropositive for Leishmania infantum (syn. L. chagasi), a serological and molecular study was conducted to detect Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Babesia vogeli in 60 serum and spleen samples. A confirmatory diagnosis of L. infantum based on serological and molecular assays was also performed, as was sequence alignment and phylogenetic analysis to assess the identity of the parasite species infecting these animals. IgG antibodies to Ehrlichia spp., B. vogeli and L. infantum were found, respectively, in 39 (65%), 49 (81.6%) and 60 (100%) of the sampled dogs. Twenty-seven (45%), fifty-four (90%), fifty-three (88.3%), two (3.3%) and one (1.6%) dog were positive, respectively, for E. canis, Leishmania spp., Leishmania donovani complex, Babesia sp. and Anaplasma sp. in PCR assays. After sequencing, the amplicons showed 99% of identity with E. canis, B. vogeli, A. platys and Leishmania chagasi isolates. The findings of this study indicate that L. infantum-seropositive dogs from Campo Grande are exposed to multiple tick-borne pathogens, which should therefore be included in the differential diagnosis of dogs with clinical suspicion of leishmaniasis.

Patógenos transmitidos por carrapatos atingem uma variedade de hospedeiros vertebrados. Para identificar os agentes patogênicos transmitidos por carrapatos entre cães soropositivos para Leishmania infantum no município Campo Grande-MS, foi realizado um estudo sorológico e molecular para a detecção de Ehrlichia canis, Anaplasma platys e Babesia vogeli em 60 amostras de soro e baço, respectivamente. Adicionalmente, foi realizado o diagnóstico confirmatório de L. infantum por meio de técnicas sorológicas e moleculares. Também foi realizado o alinhamento e análise filogenética das sequências para indicar a identidade das espécies de parasitas que infectam esses animais. Anticorpos IgG anti-Ehrlichia spp., anti-B. vogeli e anti-L. infantum foram detectados em 39 (65%), 49 (81,6%) e 60 (100%) dos cães amostrados, respectivamente. Vinte e sete (45%), cinquenta e quatro (90%), cinquenta e três (88,3%), dois (3,3%) e um (1,6%) cães mostraram-se positivos na PCR para E. canis, Leishmania spp., Leishmania donovani complex, Babesia sp. e Anaplasma sp., respectivamente. Após o seqüenciamento, os amplicons mostraram 99% de similaridade com isolados de E. canis, B. vogeli e A. platys e Leishmania chagasi. Os resultados deste estudo indicaram que os cães soropositivos para L. infantum de Campo Grande, MS, são expostos a vários agentes transmitidos por carrapatos, e, portanto, devem ser incluídos no diagnóstico diferencial em cães com suspeita clínica de leishmaniose.

Application of the reverse line blot assay for the molecular de-tection of theileria and babesia sp. in sheep and goat blood samples from Pakistan

The present study was designed to detect the presence of tick-borne parasites [Theileria and Babesia spp.] in 196 blood samples collected from apparently healthy sheep and goats from two provinces, Punjab and Khyber Pukhtoon Khwa, in Pakistan. Reverse line blot [RLB] assay was applied for the parasitic detection by the amplification of hypervariable V4 region of the 18S ribosomal RNA [rRNA] gene. A membrane with covalently linked generic and species specific oligonucleotide probes was used for the hybridization of amplified PCR products. Parasites were detected in 16% of the ruminant blood samples under study. Two Theileria species, T. lestoquardi and T. ovis, were identified in samples. 25, of the total 32, infected animals were from Khyber Pukhtoon Khwa. Sheep were more prone to tick borne haemoprotozans as 81% infected samples were sheep as compared to 19% goats [P > 0.001]. Risk factor analysis revealed that male [P = 0.03], animals infested by ticks [P = 0.03] and herd composed of sheep only [P = 0.001] were more infected by blood parasites.

Detection and molecular characterization of piroplasms species from naturally infected dogs in southeast Brazil / Detecção e caracterização molecular de piroplasmas em cães naturalmente infectados no Sudeste do Brasil

Rangelia vitalii is a protozoon described from dogs in the south and southeast regions of Brazil. It is phylogenetically related to Babesia spp. that infects dogs, but data on this enigmatic parasite is still limited. The aim of this work was to detect piroplasm species in dogs in the state of Rio de Janeiro, Brazil, by 18S rRNA gene-based PCR assay, restriction fragment length polymorphism (RFLP) and sequence analyses. Of 103 dogs examined, seven (6.8%) were positive for Babesia spp. by PCR. The amplified products were digested by restriction enzymes to differentiate the Babesia species, and one sample was identified as Babesia vogeli. The pattern observed for the other six amplification products did not match with pattern described for large Babesia infecting dogs. Sequencing analysis confirmed these six samples as R. vitalii, with high homologies (99-100%) with a sequence from south Brazil. This study confirms the presence of Babesia vogeli and Rangelia vitalii circulate in domestic dogs in Teresópolis, Rio de Janeiro, Brazil.

Rangelia vitalii é um protozoário que infecta cães e foi descrito nas regiões Sul e Sudeste do Brasil. R. vitalii é filogeneticamente próxima à Babesia spp., mas dados deste misterioso parasito ainda são escassos. O objetivo deste trabalho foi detectar a presença de piroplasmas em cães naturalmente infectados no estado do Rio de Janeiro, através da amplificação do gene 18S rRNA pela PCR, clivagem com enzimas de restrição (RFLP) e caracterização genética através do sequenciamento. De 103 cães, sete (6,8%) foram positivos para Babesia spp. pela PCR. Os produtos amplificados foram digeridos por enzimas de restrição para a diferenciação das espécies de Babesia e uma amostra foi identificada como Babesia vogeli. O padrão de amplificação observado nas outras seis amostras não correspondeu ao padrão descrito para babesias que infectam cães. O sequenciamento das seis amostras confirmou ser uma espécie geneticamente idêntica a R. vitalii apresentando grande homologia (99-100%) com a sequência do sul do Brasil. Este estudo confirma a presença de Babesia vogeli e Rangelia vitalii infectando cães em Teresópolis, Rio de Janeiro, Brasil.

Detection of Babesia spp. in Free-Ranging Pukus, Kobus vardonii, on a Game Ranch in Zambia

Babesia spp. were detected from 4 asymptomatic pukus captured on a game ranch in central Zambia in October 2008. Blood smears were examined in 4 species of aymptomatic free-ranging antelopes, namely the puku (Kobus vordanii), reedbuck (Redunca arundinum), bushbuck (Tragelaphus sylvaticus), and kudu (Tragelaphus strepsiceros), and showed the presence of Babesia parasites only in the puku. In the puku, the prevalence of babesiosis was estimated at 33.3% (n=12), while the overall prevalence in all examined animals was 8.5% (n=47). The parasites showed morphological characteristics of paired ring-like stages with the length varying between 1.61 microm and 3.02 microm (mean=2.12 microm, n=27; SD=0.76 microm). Both the infected and non-infected pukus showed good body condition scores (BCS), while the dominant tick species detected from all animals were Rhipicephalus appendiculatus, Rhipicephalus spp., and Boophilus spp. To our knowledge this is the first report of Babesia spp. infection in pukus in Zambia. These findings suggest that wildlife could play an important role in the epidemiology of babesiosis in Zambia.

Serodiagnosis of Babesia equi in horses submitted to exercise stress

A complement fixation test (CFT), performed in microtitre plates, based upon the use of crude antigenic preparation of Babesia equi was adapted for the detection of antibodies in serum of infected horses. The indirect fluorescent antibody test (IFAT) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were also used for the immunodiagnosis of B. equi. Serum samples from 15 apparently healthy horses, previously conditioned to a high-speed equine treadmill, were taken before and after exercise. All the samples analyzed were positive for B. equi infection. There were no significant differences (P<0.01) between these 3 tests, or the condition of rest or stress. The combined use of CFT and IFAT or ELISA should be recommended in order to enable veterinary services to more efficiently prevent introduction of infected horses into disease-free areas.

A reação de fixação do complemento (RFC), realizada em microplacas, utilizando-se antígeno bruto de Babesia equi, foi adaptada para a detecção de anticorpos em soros de eqüinos infectados. A reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e o ensaio imunoenzimático (ELISA) também foram utilizados para o imunodiagnóstico de B. equi. Amostras de soro foram obtidas de 15 eqüinos aparentemente sadios, submetidos a treinamento físico em esteira rolante de alto desempenho, sendo as amostras colhidas antes e após os exercícios. Todas as amostras testadas foram positivas para B. equi. Não houve diferença significativa (P<0,01) entre estes 3 testes sorológicos, ou entre a condição de estresse e repouso. A combinação da RFC com a RIFI ou ELISA pode ser recomendada a fim de evitar a entrada de eqüinos portadores em áreas consideradas livres da doença.

Aislamiento de una cepa de campo de Babesia bigemina (Piroplasma: Babesiidae) y establecimiento del cultivo in vitro para la Producción de antígenos / Isolation of a field strain of Babesia bigemina (Piroplasma: Babesiidae) and establishment of in vitro culture for antigen production

Isolation of a field strain of Babesia bigemina (Piroplasma: Babesiidae) and establishment of in vitro culture for antigen production. Bovine b abesiosis, caused by Babesia bigemina, is a barrier for livestock development; it results in high economic loss to Mexican livestock. Control requires adequate antigens for diagnosis and vaccination programs. However, because of antigenic variation among Babesia strains, it is necessary to use antigens prepared from local strains. The purpose of the present study was to isolate a local field strain and to establish the in vitro culture of B. bigemina by the evaluation of the constituent's concentration of culture media. Thirty engorged female Boophilus microplus were collected from cattle suffering clinical babesiosis (B. bigemina) in Yucatan state, Mexico. These ticks were sent to the laboratory for detection of Babesia sp. vermicules. Eggs were kept at 83-85 % humidity and 27 degrees C until hatching. Larvae were transferred to an esplenectomized calf (B-1). The resulting nymphs were transferred to an esplenectomized calf (B-2). Twelve days later, B. bigemina (local strain) was detected in calf B-2 and its infected blood was frozen in liquid nitrogen to initiate the in vitro culture. The Microaerophilus Stationary Phase (MASP) in vitro culture method was used to reactivate the parasite. Three different concentrations of culture media (70, 60 and 50%), serum (30, 40 and 50%) and uninfected red blood cells (5, 10 and 15 %) were used in order to know the convenient concentrations to obtain the highest percentage of infected red blood cells (PEI). The cultured strain was used to prepare antigens for the Immunofluorescence Antibody Test (IFAT) and several concentrations of serum and conjugate were tested. Strain isolation was successful; 30 days were needed to obtain a PEI of 1.5%. The isolated strain was frozen in liquid nitrogen and the parasites were reactivated with the in vitro culture MASP method...

Obtenção de isolados puros de Babesia bovis e Babesia bigemina a partir de larvas e ninfas de Boophilus microplus em bezerros neonatos privados de colostro / Pure isolates of Babesia bigemina and Babesia bovis obtained from Boophilus microplus larvae and nymphs in colostrum- deprived newborn calves

O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo principal de obter isolados puros autóctones de B. bovis e de B. bigemina a partir do carrapato Boophilus microplus, naturalmente infectado, assegurando, dessa forma, amostras de referência regional para futuros estudos sobre o tema. Os isolados puros de B. bovis e B. bigemina foram obtidos, respectivamente, através da infestação de bezerros neonatos privados de colostro com larvas e ninfas de B. microplus, naturalmente infectadas. A condição de isolados puros foi comprovada pela soroconversão específica pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI), assim como pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e subinoculação. Os resultados confirmaram a eficácia da estratégia, anteriormente reportada, para isolamento puro de B. bovis e B. bigemina a partir de larvas e ninfas de carrapatos com infecções naturais. Concluiu-se ainda que o uso de bezerros neonatos privados de colostro, como animais suscetíveis, pode ser considerado um modelo prático, eficaz e relativamente econômico para o isolamento de hemoparasitos em regiões endêmicas.

Implementación de la técnica de PCR enla identificación de Babesia ssp en equinos / Implementation or PCR techinique in the equine identification of Babesia ssp

Aunque las técnicas de referencias citadas por la USDA y OIE son IFI y FC, para el diagnóstico de las infecciones por Babesia equi y Babesia caballi, éstas no permite la diferenciación entre las especies y no descartan resultados falsos negativos. La implementación de la PCR como técnica directa, en la identificación y carac-terización de estos parásitos, sin duda constituye un soporte al diagnóstico clínico de la piroplasmosis equina. Dado lo anteriormente expuesto en el presente trabajo se estandarizó la PCr para la identificación de B. equi y B. caballi. El procedimiento contempló la implementación de un protocolo de extracción de DNA, a partir de muestras de sangre y la optimización de PCR, tanto para la mezcla de reacción como para el programa de termociclación, junto a 4 partidores: P1 y P2 para B equi y P3 y P4 para B caballi. Ambos amplifican en forma selectiva una secuencia conservada de los genes de 16S rDNA, equivalentes a 659 bp para B. caballi y 664 bp para B. equi. La sensibilidad técnica fue de 0,1ng/ml para B. equi y 1ng/ml para B. caballi. El estudio de especificidad técnica no mostró productos de amplificación al utilizar DNAs de Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Echinococcus granulosus, Fasciola hepatica. Se estudiaron 77 muestras de sangre de equinos provenientes de la Región Metropolitana de Chile con y sin sospecha clínica, de las cuales 15 resultaron positivas (14 a B. equi y 1 a B. caballi). Nuestros resultados crearon la necesidad de una evaluación epidemiológica de la PCR y su confrontación con otras técnicas de diagnóstico directo, para lo cual en la actualidad se estudian muestras de sangre equina con sospecha a piroplasmosis.

A conglutination test for rapid detection of antibodies against Babesia bigemina

A rapid conglutination test (RCT) with performance comparable to the indirect fluorescent antibody technique (IFAT) was developed to detect antibodies against Babesia bigemina (B. bigemina-RCT). The B. bigemina-RCT is a sensitive, specific, economical, and rapidly performed serological test suitable for field application or minimally equipped laboratories. This test had a sensitivity of 90.9 percent, and specificity of 97.6 percent, compared to IFAT, which showed for the same parameters respectively, 98.3 percent and 99.7 percent. The early detection of anti- B. bigemina immunoglobulins by RCT in experimental infections was nearly parallel to that of IFAT. Cross reactions were observed with sera from calves experimentally infected with Babesia bovis (1.8 percent) and with Anaplasma marginale (1.2 percent). RCT antigen prepared with non parasitized erythrocytes (negative antigen) showed 1.5 percent, 3.5 percent and 2.2 percent of positive reactions with sera from animals experimentally infected with B. bigemina, B. bovis and A. marginale. However, none of the sera from animals of endemic areas for babesia infection resulted in positive reactions with the negative antigen. Considering these results and shelf life over six months, the B. bigemina-RCT could be used for epidemiological surveys and evaluation of control measures against this species of Babesia.

Um teste rápido de conglutinação (TCR) com desempenho comparável a imunofluorencência indireta (IFI) foi desenvolvido para detectar anticorpos contra Babesia bigemina. O TCR-B.bigemina é um teste sorológico sensível, econômico e executável rapidamente; apropriado para condições de campo ou laboratórios com estrutura mínima. Este teste tem uma sensibilidade de 90,9% e especificidade de 97,6%, enquanto que a IFI apresentou para os mesmos parâmetros, respectivamente, 98,3% e 99,7%. Nas infecções experimentais a detecção de imunoglobulinas anti-B. bigemina pelo TCR foi aproximadamente a mesma da IFI. As reações cruzadas verificadas nos soros de bezerros experimentalmente infectados com Babesia bovis e Anaplasma marginale foram 1,8% e 1,2%, respectivamente. O antígeno preparado com eritrócitos não parasitados (antígeno negativo) apresentou 1,5%, 3,5% e 2,2% de reações positivas com os soros de animais infectados com B. bigemina, B. bovis e A. marginale. Entretanto, nenhum dos soros dos animais de áreas endêmicas para infecção de babésia resultaram em reações positivas com o antígeno negativo. Considerando estes resultados e o período de viabilidade do antígeno de TCR, acima de seis meses, possibilita o TCR-B. bigemina ser utilizado em levantamentos epidemiológicos e na avaliação das medidas de controle contra esta espécie de Babesia.

Isolation of Babesia bigemina and Babesia bovis merozoites by ammonium chloride lysis of infected erythrocytes

1. We describe the isolation of viable merozoites from erythrocytes infected with Babesia bovis or Babesia bigemina organisms by ammonium chloride lysis. 2. Parasite morphology was examined by both light and transmission electron microscopy. Erythrocyte-free parasites maintain their viability and infectivity, retain their antigenicity and are suitable for use in the indirect fluorescent antibody assay