Analysis on the prokaryotic microbiome in females and embryonic cell cultures of Rhipicephalus sanguineus tropical and temperate lineages from two specific localities in Brazil / Análise do microbioma procarionte de fêmeas e cultura celular embrionária de Rhipicephalus sanguineus linhagens tropical e temperada de duas localidades no Brasil

Abstract Two lineages of Rhipicephalus sanguineus are known in Brazil: the temperate or southern and the tropical or northern populations. The distribution patterns of both lineages of R. sanguineus have epidemiological implications that can affect vectorial competence concerning Ehrlichia canis, the agent of canine monocytic ehrlichiosis. Intending to identify the microbiomes of both lineages and compare microorganisms in R. sanguineus, we used the 16S rRNA (V4-V5 region) gene-based metataxonomic approach, through NGS sequencing on the MiSeq Illumina platform. We selected specimens of females from the environment and samples of primary embryonic cell cultures, from both lineages, and this was the first study to investigate the prokaryotic microbiome in tick cell cultures. The results showed that many bacterial taxa detected in the samples were typical members of the host environment. A significant diversity of microorganisms in R. sanguineus females and in embryonic cell cultures from both lineages was found, with emphasis on the presence of Coxiella in all samples, albeit in different proportions. The Coxiella species present in the two lineages of ticks may be different and may have co-evolved with them, thus driving different patterns of interactions between ticks and the pathogens that they can harbor or transmit to vertebrate hosts.

Resumo Duas linhagens de Rhipicephalus sanguineus são conhecidas no Brasil: populações da linhagem temperada ou do sul, e tropical ou do norte. Os padrões de distribuição de ambas as linhagens de R. sanguineus têm implicações epidemiológicas, podendo afetar a competência vetorial de Ehrlichia canis, o agente etiológico da erliquiose monocítica canina. Com a intenção de identificar os microbiomas de ambas as linhagens e comparar microrganismos de R. sanguineus, foi utilizada a metataxonomia, baseada no gene 16S rRNA (região V4-V5), por meio do sequenciamento de nova geração na plataforma MiSeq Illumina. Foram selecionadas amostras de fêmeas do ambiente e cultivo primário de células embrionárias, considerando-se as duas linhagens conhecidas do Brasil. Este é o primeiro estudo que investiga o microbioma procariótico de células de cultura de carrapato. Os resultados mostram que muitos grupos de bactérias detectadas nas amostras são membros típicos do ambiente do hospedeiro. Uma diversidade significativa de microrganismos em fêmeas e cultura de células embrionárias nas duas linhagens de R. sanguineus foi encontrada, com ênfase na presença de Coxiella em todas as amostras, ainda que em diferentes proporções. Possivelmente, as espécies de Coxiella presentes nas duas linhagens de carrapatos são diferentes e co-evoluíram com essas linhagens, conduzindo a diferentes padrões de interação entre carrapatos e patógenos que podem abrigar ou transmitir aos hospedeiros vertebrados.

In vitro culture of ovine mammary gland cells expressing beta-lactoglobulin and beta-casein / Células da glândula mamária ovina cultivadas in vitro expressam beta-lactoglobulina e beta-caseina

The expression of milk proteins in vitro is essential to exploit the mammary gland cells as a biological model. Enzymatic tissue disaggregation has been widely used to establish mammary cell culture, but its effect in long-term ovine mammary cell culture is not completely elucidated. This study aimed at comparing mechanical/enzymatic and mechanical dissociation methods to establish ovine mammary cell culture. We compared cellular differentiation induced by lactating ewe serum or fetal bovine serum based on the gene expression levels of milk proteins (beta-lactoglobulin, alpha s1-casein, and betacasein). Mechanically dissociated cells were positive immunostaining for cytokeratin 8.13, such as mammary epithelial cells. These cells are responsible for milk protein expression and they are low immunostaining for vimentin, mesenchymal marker. Mechanical/enzymatic dissociation cells were positive for vimentin. The fastest cell growth (cell/hour) was observed in the mechanical dissociation group cultured with 10% fetal bovine serum medium. Mechanically and mechanically/enzymatically derived cells were able to express beta-casein and beta-lactoglobulin, but not alpha s1-casein. The relative expression of beta-lactoglobulin was not affected by the tissue dissociation method or culture media, beta-casein relative expression was down regulated in mechanically dissociated cells cultured in the presence of lactating ewe serum, (P = 0.019). Beta-casein relative expression was also down regulated in mechanically/enzymatically dissociated cells cultured with fetal bovine serum (P = 0.021). In the present conditions, we conclude that mechanical dissociation followed by culture with 10% of fetal bovine serum was the most efficient method to induce milk proteins' mRNA expression by ovine mammary epithelial cells in vitro.(AU)

A expressão in vitro de proteínas do leite é essencial para explorar as células da glândula mamária como um modelo biológico. A desagregação tecidual via enzimática é amplamente utilizada para o estabelecimento cultivo de células mamárias. No entanto, seu efeito a longo prazo no cultivo de células da glândula mamária ovina ainda não é bem elucidado. Este estudo tem como objetivo comparar dois métodos de dissociação tecidual, mecânico/enzimático e mecânico, para estabelecer cultivo celular de glândula mamária ovina. A indução da diferenciação celular, por adição de soro de ovelha lactante ou soro fetal bovino, foi avaliada pelos níveis de expressão de proteínas do leite (beta-lactoglobulina, alpha s1-caseína e beta-caseína). Células mecanicamente dissociadas foram positivamente marcadas para a presença de citoqueratina 8.13, marcador para células epiteliais mamárias. Essas células são as responsáveis pela produção das proteínas do leite e são pouco marcadas para a presença de vimentina, marcador para células de origem mesenquimal. Já as células obtidas da dissociação mecânica/ enzimática foram positivamente marcadas para presença de vimentina. A maior velocidade de crescimento (células/hora) foi observado para o grupo com dissociação mecânica cultivado em meio com 10% de soro fetal bovino. As células obtidas tanto da dissociação mecânica quanto mecânica/enzimática foram capazes de expressar beta-lactoglobulina e beta-caseína, mas não alfa s1-caseína. A expressão relativa de beta-lactoglobulina não foi afetada pelo método de dissociação ou meio de cultivo. A expressão relativa da beta-caseína foi negativamente regulada para células mecanicamente dissociadas e cultivadas na presença de soro de ovelha lactante (P = 0,019). A expressão relativa da beta-caseína também foi negativamente regulada para células dissociadas de forma mecânica/enzimática e cultivadas com soro fetal bovino (P = 0,021). Nas condições do presente estudo, concluímos que o método de dissociação mecânica seguido pelo cultivo em meio com 10% de soro fetal bovino foi o método mais eficiente para induzir a expressão mRNA de proteínas do leite por células epiteliais mamárias ovinas in vitro.(AU)

Culture, characterization and differentiation of neural precursors from the central nervous system of guinea pigs (Cavia porcellus Linnaeus, 1758) / Cultura, caracterização e diferenciação de precursores neurais do sistema nervoso central de porquinho-da-índia (Cavia porcellus Linnaeus, 1758)

Potentially neurogenic areas were initially identified by incorporation of bromodeoxyuridine (BrdU) in cells underlying the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles wall, hippocampus and olfactory bulbs of newborn guinea pigs. Neural precursors from the SVZ were cultured in suspension, generating neurospheres (NSFs), which, upon dissociation were able to generate new NSFs. Upon culture in the absence of growth factors, cells dissociated from NSFs displayed evidence for neural differentiation, giving rise to cells from neural lineage. Flow cytometry analysis for of NSFs-derived cells after differentiation revealed approximately 13.3% nestin positive, 5.5% Beta-III-tubulin positive, 9% GFAP positive and 7.8% mGalC positive. Functional assays by measurement of calcium influx upon gamma butiric amino acid (GABA) and glutamate stimuli, revealed stimulation in differentiated cells, an indicator of neuronal differentiation. The ability of guinea pig SVZ cells to originate functional neurons in vitro is promising for research and towards a future use of neural stem cells in the therapy of neurological disorders.(AU)

Áreas potencialmente neurogênicas foram identificadas por incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU) na zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais, hipocampo e bulbos olfatórios de cobaias neonatos. Precursores neurais provenientes da SVZ foram cultivados em suspensão, resultando na geração de neuroesferas (NSFs), que quando dissociadas foram capazes de proliferar e gerar novas NSFs. Quando cultivadas na ausência de fatores de crescimento, as células provenientes de NSFs dissociadas apresentaram evidências de diferenciação neuronal, dando origem a células da linhagem neural. Citometria de fluxo em células das NSFs após a diferenciação revelou aproximadamente 13,3% positivas para nestina, 5,5% positivas para Beta-III-tubulina, 9% positivas para GFAP e 7,8% positivas para mGalC. Testes de funcionalidade pela mensuração de influxo de cálcio após estímulo com ácido gama amino butírico (GABA) e glutamato revelaram a estimulação de células diferenciadas, um indicador de função neuronal. A capacidade de células da SVZ de fetos de cobaias originarem células neurais funcionais in vitro é promissora para a pesquisa e eventual uso terapêutico de células tronco em disordens do sistema nervoso.(AU)

Isolation, expansion and differentiation of cellular progenitors obtained from dental pulp of agouti (Dasyprocta prymnolopha Wagler, 1831) / Isolamento, expansão e diferenciação de progenitors celulares obtidos da polpa dentária de cutia (Dasyprocta prymnolopha Wagler, 1831)

The study aimed to isolate, expand, differentiate and characterize progenitor cells existent in the dental pulp of agouti. The material was washed with PBS solution and dissociated mechanically with the aid of a scalpel blade on plates containing culture medium D-MEM/F-12, and incubated at 5% CO2-37⁰C. The growth curve, CFU assay, osteogenic/adipogenic differentiation and characterization were obtained from the isolation. The cells began to be released from the explant tissue around the 7th day of culture. By day 22 of culture, cells reached 80% confluence. At the UFC test, 81 colonies were counted with 12 days of cultivation. The growth curves before and after freezing showed a regular growth with intense proliferation and clonogenic potential. The cell differentiation showed formation of osteoblasts and fat in culture, starting at 15 days of culture in a specific medium. Flow cytometry (FACs) was as follows: CD34 (positive), CD14 (negative), CD45 (negative), CD73 (positive), CD79 (negative), CD90 (positive), CD105 (positive), demonstrating high specificity and commitment of isolated cells with mesenchymal stem cells strains. These results suggest the existence of a cell population of stem cells with mesenchymal features from the isolated tissue in the explants of agouti dental pulp, a potential model for study of stem cell strains obtained from the pulp tissue.

Isolation, expansion and differentiation of cellular progenitors obtained from dental pulp of agouti (Dasyprocta prymnolopha Wagler, 1831). Este estudo teve como objetivo isolar, expandir, diferenciar e caracterizar células progenitoras existentes na polpa dentária de cutia. O material foi lavado em solução de PBS e dissociado mecanicamente, com o auxílio de uma lâmina de bisturi, em placas contendo meio de cultura D-MEM/F-12, e incubadas em 5% de CO2-37⁰C. A curva de crescimento, o ensaio de CFU, a diferenciação osteogênica/adipogênica e a caracterização foram obtidas a partir do isolamento. As células começaram a ser liberadas, a partir do explante, em torno do sétimo dia de cultura. A partir do 22o dia, as células atingiram 80% de confluência. No teste para UFC, 81 colônias foram contadas aos 12 dias de cultivo. As curvas de crescimento pré- e pós-congelamento apresentaram crescimento regular, com intensa proliferação e potencial clonogênico. A diferenciação das células mostrou a formação de osteoblastos e de células de gordura, a partir de 15 dias de cultura em meio específico. A citometria de fluxo (FACS) apresentou-se como segue: CD34 (positivo), CD14 (negativo), CD45 (negativo), CD73 (positivo), CD79 (negativo), CD90 (positivo), CD105 (positivo), demonstrando a grande especificidade e comprometimento das células isoladas com linhagens de células-tronco mesenquimais. Estes resultados sugerem a existência de uma população de células-tronco mesenquimais isolada a partir de explantes da polpa dentária cutia, um modelo potencial para o estudo de linhagens de células-tronco obtidas a partir do tecido pulpar.

Enhancing effects of serum-rich and cytokine-supplemented culture conditions on developing blastocysts and deriving porcine parthenogenetic embryonic stem cells

The present study was conducted to develop an effective method for establishment of porcine parthenogenetic embryonic stem cells (ppESCs) from parthenogenetically activated oocyte-derived blastocysts. The addition of 10% fetal bovine serum (FBS) to the medium on the 3rd day of oocyte culturing improved the development of blastocysts, attachment of inner cell masses (ICMs) onto feeder cells, and formation of primitive ppESC colonies. ICM attachment was further enhanced by basic fibroblast growth factor, stem cell factor, and leukemia inhibitory factor. From these attached ICMs, seven ppESC lines were established. ppESC pluripotency was verified by strong enzymatic alkaline phosphatase activity and the expression of pluripotent markers OCT3/4, Nanog, and SSEA4. Moreover, the ppESCs were induced to form an embryoid body and teratoma. Differentiation into three germ layers (ectoderm, mesoderm, and endoderm) was confirmed by the expression of specific markers for the layers and histological analysis. In conclusion, data from the present study suggested that our modified culture conditions using FBS and cytokines are highly useful for improving the generation of pluripotent ppESCs.

Potencial de transdiferenciação neural das células-tronco mesenquimais da medula óssea de equino / Potential of neural transdifferentiation of mesenchymal stem cells from equine bone marrow

Os primeiros estudos demonstrando o potencial de trandiferenciação neural das células-tronco mesenquimais (CTMs) provenientes da medula óssea (MO) foram conduzidos em camundogos e humanos no início da década de 2000. Após esse período, o número de pesquisas e publicações com o mesmo propósito tem aumentado, mas com raros ou escassos estudos na espécie equina. Nesse sentindo, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial in vitro da transdiferenciação neural das CTMs provenientes da MO de equinos utilizando-se dois protocolos: P1 (forksolin e ácido retinóico) e P2 (2-βmecarptoetanol). Após a confirmação das linhagens mesenquimais, pela positividade para o marcador CD90 (X=97,94%), negatividade para o marcador CD34 e resposta positiva a diferenciação osteogênica, as CTMs foram submetidas a transdiferenciação neural (P1 e P2) para avaliação morfológica e expressão dos marcadores neurais GFAP e β3 tubulina por citometria de fluxo. Os resultados revelaram mudanças morfológicas em graus variados entre os protocolos testados. No protocolo 1, vinte quatro horas após a incubação com o meio de diferenciação neural, grande proporção de células (>80%) apresentaram morfologia semelhante a células neurais, caracterizadas por retração do corpo celular e grande número de projeções protoplasmáticas (filopodia). Por outro lado, de forma comparativa, já nos primeiros 30 minutos após a exposição ao antioxidante β-mercaptoetanol (P2) as CTMs apresentaram rápida mudança morfológica caracterizada principalmente por retração do corpo celular e menor número de projeções protoplasmáticas. Também ficou evidenciado com o uso deste protocolo, menor aderência das células após tempo de exposição ao meio de diferenciação, quando comparado ao P1. Com relação a análise imunofenotípica foi observado uma maior (P<0,001) expressão dos marcadores GFAP e β3 tubulina ao término do P2 quando comparado ao P1. A habilidade das CTMs em gerar tipos celulares relacionados a linhagem neural é complexa e multifatorial, dependendo não só dos agentes indutores, mas também do ambiente no qual estas células são cultivadas. Desta forma um maior número de estudos é necessário para o melhor entendimento do processo de transdiferenciação neural a partir de CTMs de equinos.

The first studies showing the potential of neural transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow (BM) were conducted in camundogos and humans in the early 2000s. After this period, the number of research and publications with the same purpose increased, but with rare or scarce studies in horses. The aim of this study was to evaluate in vitro neuronal transdifferentiation potential of MSCs from equine BM using two protocols: P1 (forksolin and retinoic acid) and P2 (2-βmecarptoetanol). After confirming the mesenchymal lineages, by positivity for the marker CD90 (X=97.94%), negative for the marker CD34 and positive response for osteogenic differentiation, MSCs were subjected to neural transdifferentiation (P1 and P2) for morphological analysis and expression of neural markers GFAP and β3 tubulin by flow cytometry. The results revealed morphological changes in varying degrees between the tested protocols. In protocol 1, twenty four hours after incubation with the media of neural differentiation, a large proportion of cells (>80%) had similar morphology to neural cells, characterized by retraction of cellular body and a large number of cytoplasmic extension (filopodia). However, comparatively, within the first 30 minutes after exposure to the antioxidant β-mercaptoethanol (P2) MSCs showed rapid morphological changes characterized mainly by retraction of cellular body and less cytoplasmic extension. It was also evidenced with the use of this protocol, lower cellular adhesion after exposure to media when compared to P1. Regarding the immunophenotyping analysis it was observed a higher (P<0.001) expression of the markers GFAP and β3 tubulin at the end of P2 compared to P1. The ability of MSCs to generate cell types related to neural lineage is complex and multifactorial, depending not only of inducing agents, but also the environment in which these cells will be cultivated. Thus a greater number of studies are necessary to better understand the process of neural transdifferentiation of MSCs from equine.

Diferenciação in vitro de células-tronco mesenquimais da medula óssea de cães em precursores osteogênicos / In vitro differentiation of mesenchimal stem cells of dogs into osteogenic precursors

O objetivo principal da nossa pesquisa foi avaliar o potencial de diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais (MSC) obtidas da medula óssea do cão. As MSC foram separadas pelo método Ficoll e cultivadas sob duas condições distintas: DMEM baixa glicose ou DMEM/F12, ambos contendo L-glutamina, 20% de SFB e antibióticos. Marcadores de MSC foram testados, confirmando células CD44+ e CD34- através da citometria de fluxo. Para a diferenciação osteogênica, as células foram submetidas a quatro diferentes condições: Grupo 1, as mesmas condições utilizadas para a cultura de células primárias com os meios DMEM baixa glicose suplementado; Grupo 2, as mesmas condições do Grupo 1, mais os indutores de diferenciação dexametasona, ácido ascórbico e b-glicerolfosfato; Grupo 3, células cultivadas com meios DMEM/F12 suplementado; e Grupo 4, nas mesmas condições que no Grupo 3, mais indutores de diferenciação de dexametasona, ácido ascórbico e b-glicerolfosfato. A diferenciação celular foi confirmada através da coloração com alizarin red e da imunomarcação com o anticorpo SP7/Osterix. Nós observamos através da coloração com alizarin red que o depósito de cálcio foi mais evidente nas células cultivadas em DMEM/F12. Além disso, usando a imunomarcação com o anticorpo SP/7Osterix obtivemos positividade em 1:6 células para o Meio DMEM/F12 comparada com 1:12 para o meio DMEM-baixa glicose. Com base nos nossos resultados concluímos que o meio DMEM/F12 é mais eficiente para a indução da diferenciação de células-tronco mesenquimais caninas em promotores osteogênicos. Este efeito provavelmente ocorre em decorrência da maior quantidade de glicose neste meio, bem como da presença de diversos aminoácidos.

The aim of our research was to evaluate the potential for osteogenic differentiation of mesenchimal stem cells (MSC) obtained from dog bone marrow. The MSC were separated using the Ficoll method and cultured under two different conditions: DMEM low glucose or DMEM/F12, both containing L-glutamine, 20% of FBS and antibiotics. MSC markers were tested, confirming CD44+ and CD34- cells with flow cytometry. For osteogenic differentiation, cells were submitted to four different conditions: Group 1, same conditions used for primary cell culture with DMEM supplemented media; Group 2, same conditions of Group 1 plus differentiation inductors Dexametazone, ascorbic acid and β-glicerolphosphate. Group 3, Cells cultured with supplemented DMEM/F12 media, and Group 4, same conditions as in Group 3 plus differentiation inductors Dexametazone, ascorbic acid and β-glicerolphosphate. The cellular differentiation was confirmed using alizarin red and imunostaining with SP7/Osterix antibody. We observed by alizarin staining that calcium deposit was more evident in cells cultivated in DMEM/F12.Furthermore, by SP/7Osterix antibody immunostaining we obtained 1:6 positive cells when using DMEM/F12 compared with 1:12 for low-glucose DMEM. Based on our results, we conclude that the medium DMEM/F12 is more efficient for induction of differentiation of mesenchymal stem cells in canine osteogenic progenitors. This effect is probably due to the greater amount of glucose in the medium and the presence of various amino acids.

Progesterone and Follicle Stimulating Hormone interact and promote goat preantral follicles survival and development in vitro / Progesterona e Hormônio Folículo-Estimulante interagem e promovem a sobrevivência e o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos

We investigated the effects of progesterone and follicle stimulating hormone (FSH) on survival and growth of caprine preantral follicles. Pieces of ovarian tissue were cultured for 1 or 7 days in minimum essential medium (MEM) alone or containing progesterone (1, 2.5, 5, 10 or 20ng/mL), FSH (50ng/mL) or the interaction between progesterone and FSH. Fresh (non-cultured control) and cultured ovarian tissues were processed for histological and ultrastructural studies. After 7 days the addition of FSH to all progesterone concentrations maintained the percentage of normal follicles similar to fresh control. At day 7 of culture, a higher percentage of developing follicles was observed only in 2.5ng/ml of progesterone associated with FSH or 10ng/ml of progesterone alone when compared with control. From day 1 to day 7 of culture, a significant increase in the percentage of developing follicles was observed in MEM and 2.5ng/ml of progesterone + FSH. In addition, after 7 days, in all treatments, there was a significant increase in follicular diameter when compared with control, except for MEM alone and in 5ng/ml of progesterone + FSH or 10ng/ml of progesterone alone. Ultrastructural studies confirmed follicular integrity after 7 days of culture in 2.5ng/ml of progesterone with FSH. In conclusion, this study demonstrated that the interaction between progesterone and FSH maintains ultrastructural integrity, stimulates primordial follicles activation and further growth of cultured caprine preantral follicles.

Este trabalho verificou os efeitos da progesterona e do hormônio folículo-estimulante (FSH) na sobrevivência e no crescimento de folículos pré-antrais caprinos. Fragmentos de tecido ovariano foram cultivados por 1 ou 7 dias em Meio Essencial Mínimo (MEM) sozinho ou contendo progesterona (1, 2.5, 5, 10 ou 20ng/mL), FSH (50ng/mL) ou a combinação entre esses dois hormônios. O tecido fresco (controle não-cultivado) e o cultivado foram processados para análise histológica e ultra-estrutural. Após 7 dias a adição de FSH a todas as concentrações de progesterone manteve o percentual de folículos normais similar ao controle fresco. No dia 7 de cultivo, um alto percentual de folículos em desenvolvimento foi observado somente no tratamento com 2,5ng/ml de progesterona associada ao FSH ou com 10ng/ml de progesterona sozinha, em relação ao controle fresco. Do dia 1 para o dia 7 de cultivo, um aumento significativo no percentual de folículos em desenvolvimento foi observado no MEM sozinho e adicionado de 2,5ng/ml de progesterona + FSH. Além disso, após 7 dias, em todos os tratamentos, houve um aumento significativo no diâmetro folicular em relação ao controle, exceto nos tratamentos com MEM sozinho, 5ng/ml de progesterona + FSH ou 10ng/ml de progesterona sozinha. A análise ultra-estrutural confirmou a integridade follicular após 7 dias de cultivo no tratamento com 2,5ng/ml de progesterona + FSH. Em conclusão, este estudo demonstrou que a interação entre progesterona e FSH mantém a integridade ultra-estrutural, estimula a ativação de folículos primordiais e o posterior crescimento de folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro.

Vacina experimental produzida em cultivo celular confere proteção parcial contra o ectima contagioso em ovinos / Experimental vaccine produced in tissue culture confers partial protection against contagious ecthyma in sheep

O ectima contagioso (também conhecido como orf), é uma doença debilitante de ovinos e caprinos causada pelo vírus do orf (ORFV). A vacinação tem sido usada com relativo sucesso no controle da doença. No entanto, as vacinas atuais contêm amostras virulentas do agente, são produzidas por escarificação cutânea de animais, e apresentam eficácia questionável. Assim, o presente trabalho teve como objetivo produzir e testar a eficácia de uma vacina experimental produzida em cultivo celular. A cepa IA-82 do ORFV foi submetida a 21 passagens em cultivo de células BHK-21 e usada para vacinar ovinos jovens (n=30), por escarificação cutânea na face interna da coxa. A vacinação produziu pústulas e crostas em 16 dos 30 ovinos vacinados, indicando imunização adequada. Noventa dias após a vacinação, ovinos vacinados (n=16) e controles (n=16) foram inoculados com uma cepa virulenta do ORFV (10(6,9)DICC50/mL) após escarificação na comissura labial. Todos os animais desenvolveram lesões típicas de ectima, incluindo hiperemia, vesículas, pústulas e crostas. No entanto, os animais vacinados desenvolveram lesões mais leves e passageiras do que os controles, e os escores clínicos foram estatisticamente diferentes (p<0,05) entre os dias 10 e 22 pós-desafio. Além disso, o tempo de duração da doença foi significativamente inferior (p<0,05) nos animais vacinados. Os animais vacinados também excretaram menor quantidade de vírus (p<0,05) e por um período significativamente mais curto do que os controles (13 dias versus 22 dias, p<0,001). Esses resultados demonstram a proteção parcial conferida pela vacina experimental e, dependendo da melhoria dos índices de imunização e proteção, são promissores no sentido da utilização de vacinas contra o ORFV produzidas em cultivo celular.

Contagious ecthyma, also known as orf, is a debilitating disease of sheep and goats caused by the parapoxvirus, orf virus (ORFV). Vaccination has been used with relative success to reduce the losses caused by the disease, yet the current vaccines contain virulent virus, are empirically produced through skin scarification of live lambs, and present questionable efficacy. Therefore, the present study aimed at developing and testing an experimental ORFV vaccine produced in tissue culture. The ORFV strain IA-82 was submitted to 21 passages in BHK-21 cells and then used to immunize lam bs (n=30) through skin scarification of the internal face of the hind limb. Vaccination produced localized pustules and scabs lesions in 16 out of 30 animals, indicating an adequate replication of the vaccine virus. Ninety days after vaccination, vaccinated (n=16) and control lambs (n=16) were inoculated with a virulent ORFV strain (10(6,9)TCID50/ml) in the labial commissure. Vaccinated and control lambs developed typical orf lesions, characterized by hyperemia, vesicles, pustules and scab formation. Nonetheless, vaccinated animals developed milder lesions compared to controls and the clinical scores were significantly lower (p<0.05) between days 10 and 22 post-challenge. In addition, the mean duration of clinical disease was significantly reduced in vaccinated animals (p<0.05). Furthermore, vaccinated animals excreted much less virus (p<0.05) and for a significantly shorter period of time than did the controls (13 days versus 22 days, p<0.001). These results demonstrate partial protection by the experimental vaccine and, upon improvement of immunization and protection indices, are promising towards the use of tissue culture-based ORFV vaccines.

Replacement of fetal calf serum by human serum as supplementation for human fibroblast culture / Substituição de soro bovino fetal por soro humano como suplemento para cultura de fibroblastos humanos

INTRODUCTION: Fetal calf serum (FCS) is commonly used as a supplement in the culture medium for fibroblast cells. This supplementation is far from ideal as sample quality varies from batch to batch and the composition of FCS is not completely known. In addition, FCS may be contaminated with viruses and/or prions and may also cause adverse immunologic responses in humans. Due to these facts, a worldwide effort is being made to find alternatives for xenobiotic elements in cell cultures. Human serum could be a safer alternative, especially for clinical application. METHODS: We investigated human serum as a substitute for FCS in human fibroblast culture. Fresh human serum was obtained from 10 healthy volunteers. Fibroblasts were cultivated in multiwell plates containing either Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) plus 10 percent FCS (D10) or DMEM plus 10 percent human serum (D10H). Cell counts were obtained between 24 and 264 hours of cultivation; results were expressed as the mean number of cells ± standard error of the mean to create cell proliferation curves. RESULTS: There was no statistical difference in fibroblast proliferation between the two groups. Human serum supported human fibroblast growth and proliferation, suggesting that it may be a potential substitute for FCS in human cell culture. Cells cultivated with human serum presented a different morphology, appearing smaller and more rounded as compared to cells cultivated in D10. CONCLUSIONS: These results demonstrate that human serum can be substituted for FCS in human fibroblasts culture and that fibroblasts cultivated in the presence of human serum have a morphology that is similar to in vivo fibroblasts.

INTRODUÇÃO: Soro bovino fetal (SBF) é comumente usado como suplemento no meio de cultura para cultivar fibroblastos. Essa forma de suplementação, porém, não é ideal, pois a qualidade das amostras de SBF é variada e sua composição não é completamente conhecida. Além disso, o SBF pode apresentar contaminação por vírus e príons ou causar complicações imunológicas. Assim, a comunidade científica tem buscado alternativas ao uso de elementos xenobióticos em cultura celular. O soro humano pode ser uma dessas alternativas, principalmente para aplicação clínica. MÉTODO: Soro humano, obtido de sangue de 10 voluntários saudáveis submetidos a avaliação sorológica prévia, foi testado como substituto do SBF em cultura de fibroblastos humanos. As células foram cultivadas em placas multipoços, contendo Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mais 10 por cento de SBF (D10) ou DMEM mais 10 por cento de sroro humano (D10H). Entre 24 e 264 horas de exposição aos meios testados, as células foram contadas e os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média, para obtenção de curvas de proliferação celular. RESULTADOS: Não houve diferença estatística entre os grupos de proliferação. Fibroblastos na presença de soro humano aparentavam ser menores e mais arredondados em comparação àqueles mantidos em D10. CONCLUSÕES: Os resultados permitem inferir que o soro humano pode substituir o SBF em cultura de fibroblastos e que fibroblastos cultivados em meio suplementado por soro humano apresentam morfologia mais semelhante àqueles in vivo.

Atividade de três drogas antivirais sobre os herpesvírus bovino tipos 1, 2 e 5 em cultivo celular / Activity of three antiviral drugs against bovine herpesviruses 1, 2 and 5 in cell culture

The activity of three anti-herpetic drugs (Acyclovir [ACV], Gancyclovir [GCV] and Foscarnet [PFA]) was tested against bovine herpesvirus 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2) and 5 (BoHV-5) in vitro using the plaque reduction assay. Different drug concentrations were tested against one hundred 50 percent tissue culture infectious dose (TCID50) of the respective viruses. Drug concentrations lower than 200μg/mL resulted in viability rates of more than 80 percent for MDBK and Hep2 cells in the MTT test (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). The selectivity index (IS) of the drugs was calculated dividing the concentration of the drug that is cytotoxic for 50 percent of the cells (CC50) by the concentration of the drug that was effective in reducing by 50 percent the number of viral plaques (EC50) for the three herpesviruses. Thus, ACV was shown to be moderately active against BoHV-1 (EC50: 112.9μg/mL; IS: 4.5), BoHV-2 (EC50: 114.2μg/mL; IS: 4.5) and BoHV-5 (EC50: 96.9μg/mL; IS: 5.3). GCV was effective against BoHV-2 (EC50: 33.5μg/mL; IS: 16.6), moderately effective against BoHV-5 (EC50: 123.2μg/mL; IS: 4.5) and poorly active against BoHV-1 (EC50: 335.8μg/mL; IS: 1.7). PFA exhibited the highest antiviral activity, being the only drug that, at concentration of 100μg/mL, completely inhibited plaque formation by all three viruses. PFA was the most effective in vitro against BoHV-1 (EC50: 29.5μg/mL; IS: 42.2), BoHV-2 (EC50: 45.2μg/mL; IS: 27.6) and BoHV-5 (EC50: 7.8μg/mL; IS: 160.6). Thus, the results indicate that PFA is a promising candidate for experimental therapeutic testing in vivo against bovine herpesviruses.

A atividade de três fármacos antivirais (Aciclovir [ACV], Ganciclovir [GCV] e Foscarnet [PFA]) foi testada in vitro frente aos herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2) e 5 (BoHV-5). Para isso, utilizou-se o teste de reducao de placas virais em cultivo celular, testando-se diferentes concentracoes dos farmacos frente a 100 doses infectantes para 50 por cento dos cultivos celulares (DICC50) dos respectivos virus. Pelo teste de MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), verificou-se que concentracoes inferiores a 200ƒÊg/mL dos tres antivirais resultaram em indices de viabilidade de celulas MDBK e Hep2 superiores a 80 por cento. Com base na concentracao citotoxica para 50 por cento das celulas (CC50) e na concentracao dos farmacos efetiva para inibir em 50 por cento o numero de placas virais (EC50), calculou-se o indice de seletividade (IS) dos antivirais para os tres herpesvirus. Assim, o ACV demonstrou ser moderadamente ativo frente ao BoHV-1 (EC50: 112,9ƒÊg/mL e IS: 4,5), ao BoHV-2 (EC50: 114,2 ƒÊg/mL e IS: 4,5) e BoHV-5 (EC50: 96,9ƒÊg/mL e IS: 5,3). O GCV apresentou atividade moderada frente ao BoHV-2 (EC50: 33,5ƒÊg/mL e IS: 16,6) e, em menor grau, contra o BoHV-5 (EC50: 123,2ƒÊg/mL e IS: 4,5), sendo ineficaz frente ao BoHV-1 (EC50: 335,8ƒÊg/mL e IS: 1,7). O PFA apresentou atividade antiviral mais pronunciada, sendo o unico farmaco que, na concentracao de 100ƒÊg/mL, inibiu completamente a producao de placas pelos tres virus testados. O PFA foi o mais efetivo in vitro frente ao BoHV-1 (EC50: 29,5ƒÊg/mL e IS: 42,2), ao BoHV-2 (EC50: 45,2ƒÊg/mL e IS: 27,6) e ao BoHV-5 (EC50: 7,8ƒÊg/mL e IS: 160,6). Portanto, os resultados obtidos indicam que o PFA pode se constituir em um candidato para terapia experimental de infeccoes pelos herpesvirus de bovinos in vivo.

Presença de pestivírus e anticorpos contra pestivírus em soros e cultivos celulares / Presence of pestiviruses and antibodies to pestiviruses in sera and cell cultures

Cultivos celulares e soro utilizados como suplemento de meios de cultivo foram examinados em busca de pestivírus ou anticorpos contra pestivírus, por técnicas de isolamento de vírus e soro-neutralizaçäo, seguidas de revelaçäo por imunoperoxidase. Sete de um total de 13 partidas de linhagens celulares, incluindo células de origem bovina (MDBK, GBK, BT), ovina (FLK) e suína (SK6, PK15), apresentavam-se contaminadas com pestivírus. Uma linhagem celular de origem de rim de coelho (RK13) näo apresentou contaminaçäo. Duas de sete partidas de cultivos primários de testículos de neonatos bovinos preparados no local também se encontraram infectados. Soros de neonatos bovinos obtidos de abatedouros continham pestivírus em oito de 80 amostras e anticorpos anti-pestivírus em 15 de 80 amostras examinadas. Soro fetal bovino adquirido comercialmente de diferentes firmas apresentou anticorpos anti-pestivírus em quatro de oito amostras examinadas