Cytotoxic Effects of Zoledronic Acid on Human Epithelial Cells and Gingival Fibroblasts

Bisphosphonate-induced osteonecrosis has been related to the cytotoxicity of these drugs on oral mucosa cells. A previous study showed that 5 µM of zoledronic acid (ZA), a nitrogen-containing bisphosphonate, is the highest concentration of this drug found in the oral cavity of patients under treatment. Therefore, in order to simulate an osteonecrosis clinical condition, the aim of this study was to evaluate the highest concentration of ZA applied on human epithelial cells (HaCaT) and gingival fibroblasts. For this purpose, cells (3×104 cells/cm2) were seeded in wells for 48 h using complete culture medium (cDMEM). After 48 h incubation, the cDMEM was replaced by fresh serum-free culture medium (DMEM-FBS) in which the cells were maintained for additional 24 h. Then, 5 µM ZA were added to the DMEM–FBS and the cells incubated in contact with the drug for 48 h. After this period, the number of viable cells (trypan blue), cell viability (MTT assay), total protein (TP) production and cell morphology (SEM analysis) were assessed. Data were analyzed statistically by Mann-Whitney, ANOVA and Tukey's test (α=0.05). ZA caused a significant reduction in the number of viable cells and decreased the metabolic activity of both cell lines. However, decrease of TP production occurred only in the epithelial cell cultures. Morphological alterations were observed in both cell types treated with ZA. In conclusion, ZA (5 µM) was cytotoxic to human epithelial cells and gingival fibroblast cultures, which could be associated, clinically, with the development of bisphosphonate-induced osteonecrosis.

A osteonecrose induzida por bisfosfonatos tem sido associada a um efeito citotóxico destes medicamentos sobre as células da mucosa oral. Um estudo recente demonstrou que 5 µM de ácido zoledrônico (AZ), um potente bisfosfonato nitrogenado, foi a maior concentração encontrada na cavidade oral da pacientes em tratamento com este medicamento. Portanto, para simular esta condição in vivo, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da aplicação desta concentração de AZ sobre células epiteliais (HaCaT) e fibroblasto de gengiva. As células foram semeadas (3×104 células/cm2) e incubadas por 48 h em placas de 24 compartimentos, utilizando meio de cultura completo (cDMEM). Após permanecer por 24 h em DMEM sem soro fetal bovino (DMEM-SFB), 5 µM do AZ foram adicionados a este meio de cultura, o qual foi incubado em contato com as células por 48 h. Após este período, foram avaliados o número de células viáveis (trypan blue), viabilidade celular (teste de MTT), produção de proteína total e a morfologia celular (MEV). Os dados obtidos foram submetidos aos testes estatísticos de Mann-Whitney e ANOVA complementada por testes de Tukey (p>0,05). Foi demonstrado que o AZ causou diminuição significativa no número de células viáveis, além de redução do metabolismo celular para ambos os tipos celulares avaliados. Porém, redução na produção de proteína total ocorreu apenas para as células epiteliais. Alterações morfológicas foram observadas em ambos os tipos celulares tratados com AZ. Estes dados científicos indicam que a concentração de AZ avaliada neste estudo (5 µM) apresenta ação citotóxica sobre células epiteliais e fibroblastos de gengiva, o que poderia estar associado, clinicamente, ao desenvolvimento da osteonecrose induzida por bisfosfonatos.

Toxicología preclínica de bisfosfonatos / Preclinical toxicology of bisphosphonates

Los bisfosfonatos regulan el recambio óseo por inhibición de la reabsorción óssea osteoclástica. Sus características farmacodinémicas y farmacocinéticas les confieren un particular perfil fármaco-toxicológico, determinado en gran parte por su alto grado de especialidad escasa o nula distribución en tejidos blandos, fuerte afinidad por tejidos calcificados. Los estudios de toxicología preclínica, cuyo objetivo principal es localizar el o los órganos blanco de toxicidad y estimar el margen de seguridad de un "candidato a agente terapéutico" en animales de experimentación, permiten extraer conclusiones generales que, en el caso de los bisfosfonatos, se avalan con resultados propios y obtenidos en la literatura. Se consideran distintos integrantes de este grupo farmacológico: Alendronato, Clodronato, Etidronato, Olpadronato, Pamidronato. En general, deben administrarse dosis muy altas de bisfosfonatos para la observación, en grado e incidencia variable, de efectos tóxicos extraesqueléticos: reacción local, hipocalcemia- y sus consecuencias sobre el sistema cardiovascular y la posibilidad de tetania-, afectación de las estructuras dentarias y disfunción renal. La mayoría de estos efectos pueden atribuirse a la escasa solubilidad en fluídos biológicos, a la formación de complejos con el ión calcio, a su potente efecto inhibitorio de la reabsorción ósea endógena o inducida y a su principal vía de excreción. Otros efectos tóxicos (oculares, pulmonares, hepáticos), pueden relacionarse con excesivas dosis reiteradas. Si se considera la cantidad total de Olpadronato administrada a distintas especies animales en estudios toxicológicos y en modelos experimentales farmacodinámicos (osteopenias por deprivación estrogénica e inmovilización, hipercalcemia inducida por retinoides), se puede estimar un margen de seguridad de 200-300:1 entre las dosis "tóxicas" y "farmacológicas". Si las dosis tóxicas en animales se relacionan con las máximas propuestas para humanos, la relación asciende a 300 - 1000:1 dependiendo de la patología y la vía de administración consideradas. Con respecto a su efecto óseo, los datos experimentales con los nuevos bisfosfonatos sugieren un marcado alejamiento entre dosis activas farmacológicamente y aquellas que producen defectos en la mineralización ósea. La exagerada inhibición del remodelamiento óseo, producto del empleo de altas dosis en animales normales, es la natural consecuencia del efecto farmacológico de este tipo de compuestos. ...