Formação de biofilmes monotípicos e heterotípicos por Enterococcus faecalis E Enterococcus faecium em dentina radicular / Formation of monotypic and heterotypic biofilm by Enterococcus faecalis E Enterococcus faecium in root dentin

E. faecalis e E. faecium possuem grande relevância nas infecções hospitalares por apresentarem facilidade em adquirir resistência aos antibióticos. E. faecalis também apresentam alta prevalência nas infecções endodônticas, entretanto a importância de E. faecium para a odontologia ainda precisa ser esclarecida. Assim, o objetivo desse estudo foi comparar cepas clínicas de E. faecium com as cepas de E. faecalis em relação a capacidade de formação de biofilme na dentina radicular e penetração nos túbulos dentinários. Além disso, foi avaliada a interação dessas espécies em biofilmes mistos. Para a realização desse estudo, foram utilizadas cepas clínicas, previamante, isoladas de canais radiculares com infecções endodõnticas e identificadas pelo PCR multiplex. Entre as cepas isoladas, foram selecionadas 4 cepas de E. faecalis e 2 cepas de E. faecium. Primeiramente, foi realizado a formação dos biofilmes monotípicos das cepas de E. faecalis e E. faecium sobre dentinas radiculares de dentes bovinos. Os biofilmes foram formados em placas de microtitulação por diferentes tempos: 2, 4, 6, 24, 48, 72, 96 e 120 horas. Os biofilmes formados foram, então, analisados pela contagem de células viáveis (UFC/mL) e quantificação da biomassa total (método do cristal violeta). Além disso, os biofilmes foram analisados por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) procurando-se observar a penetração das células de E. faecalis e E. faecium nos túbulos dentinários. A seguir foram formados biofilmes heterotípicos de E. faecalis e E. faecium para estudo das interações ecológicas estabelecidas entre as espécies. A análise dos biofilmes heterotípicos foi feita pela quantificação da biomassa total (cristal violeta) procurando-se detectar a presença de relações sinérgicas ou antagônicas. Os resultados foram submetidos à Análise de Variância (ANOVA) e teste de Tukey, considerando-se nível de 5%. Os resultados obtidos na contagem de UFC/mL dos biofilmes monotípicos, revelaram que as 6 cepas testadas apresentam grande capacidade para formar biofilmes na dentina radicular, alcançando valores de UFC/mL entre 8 a 12 log de acordo com o tempo de observação. Em relação a análise das imagens de MEV, as cepas clínicas de E. faecalis e E. faecium demonstraram capacidade semelhante para formar biofilmes e penetrar nos túbulos dentinários. Na comparação da quantificação da biomassa dos biofilmes monotípicos e heterotípicos, observamos que a interação das cepas clínicas E. faecalis e E. faecium favoreceu a adesão e crescimento do biofilme. Assim, concluiuse que as cepas de E. faecalis e E. faecium apresentam a mesma capacidade de formar biofilmes sobre a superfície radicular. Além disso, em biofilmes mistos, essas duas espécies estabelecem relações ecológicas sinérgicas, aumentando significativamente a formação de biofilmes(AU)

E. faecalis and E. faecium have a high relevance in hospital infections because they are easy to acquire resistance to antibiotics. E. faecalis also present high prevalence in endodontic infections, however the importance of E. faecium for dentistry still needs to be clarified. Thus, the objective of this study was to compare clinical strains of E. faecium with strains of E. faecalis in relation to the capacity of biofilm formation in root dentin and penetration into the dentin tubules. In addition, the interaction of these species in mixed biofilms was evaluated. In order to perform this study, clinical strains were used, pre-determined, isolated from root canals with endodontic infections and identified by multiplex PCR. Among the isolated strains, 4 strains of E. faecalis and 2 strains of E. faecium were selected. Firstly, the formation of the monotypic biofilms of the strains of E. faecalis and E. faecium on root dentin of bovine teeth was carried out. The biofilms were formed in microtiter plates at different times: 2, 4, 6, 24, 48, 72, 96 and 120 hours. The biofilms formed were then analyzed by counting viable cells (CFU / mL) and quantification of total biomass (violet crystal method). In addition, the biofilms were analyzed by Scanning Electron Microscopy (SEM), aiming to observe the penetration of E. faecalis and E. faecium cells into the dentin tubules. Then, heterophilic biofilms of E. faecalis and E. faecium were formed to study the ecological interactions established between the species. The analysis of the heterotypic biofilms was made by quantifying the total biomass (violet crystal) in order to detect the presence of synergistic or antagonistic relationships The results were submitted to Analysis of Variance (ANOVA) and Tukey test, considering a level of 5%. The results obtained in the CFU / mL count of the monotypic biofilms revealed that the six strains tested had a great capacity to form biofilms in the root dentin, reaching values of CFU / mL between 8 and 12 log according to the time of observation. In relation to SEM images, the clinical strains of E. faecalis and E. faecium demonstrated similar capacity to form biofilms and to penetrate the dentinal tubules. In the comparison of the biomass quantification of the monotypic and heterotypic biofilms, we observed that the interaction of the clinical strains E. faecalis and E. faecium favored the adhesion and growth of the biofilm. Thus, it was concluded that strains of E. faecalis and E. faecium have the same ability to form biofilms on the root surface. In addition, in mixed biofilms, these two species establish synergistic ecological relationships, significantly increasing the formation of biofilms(AU)

Efeito antimicrobiano do bacteriófago geneticamente modificado φEf11/φFL1C(Δ36)PnisA sobre cepas de E. faecalis em biofilme estático e em canais radiculares infectados / Antibacterial effect of a Genetically-Engineered Bacteriophage φEf11/φFL1C(Δ36)PnisA on static biofilms and on Dentin Infected with E. faecalis

A presença de micro-organismos no sistema de canais radiculares (SCR) tem sido apontada como uma das principais causas de insucesso da terapia endodôntica. A capacidade de formar biofilme e penetrar nos túbulos dentinários são fatores de sobrevivência que favorecem a perpetuação de micro-organismos no interior do SCR. Terapias que promovam a desorganizazão de biofilmes e eliminação de bactérias dentro dos túbulos dentinários são fundamentais para a desinfecção endodôntica. Uma terapia descoberta há um século, denominada de Bacteriofagoterapia, baseia-se na utilização de vírus capazes de infectar e matar bactérias. Esta abordagem antimicrobiana tem recebido bastante atenção atualmente por representar uma alternativa para o tratamento de doenças causadas por bactérias multirresistentes aos antibióticos. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia de um bacteriófago modificado geneticamente, φEf11/φFL1C(Δ36)PnisA, para eliminar biofilmes de duas cepas de E. faecalis: JH2-2 (sensível à vancomicina e resistente ao ácido fusídico e à rifampicina) e V583 (resistente à vancomicina). Este estudo foi dividido em dois experimentos distintos. No primeiro experimento, biofilmes estáticos de 48 horas de cepas de E. faecalis JH2-2 (pMSP3535 nisR / K) ou V583 (pMSP3535 nisR / K) formados em lâminulas de vidro (coverslips) foram inoculados por suspensão do bacteriófago φEf11/φFL1C(Δ36)PnisA. Após 48 horas de incubação, a biomassa bacteriana foi fotografada por microscopia confocal e as células viáveis foram quantificadas por medição de unidades formadoras de colônias (UFC). No segundo experimento, segmentos radiculares de dentes humanos extraídos foram cimentados em dispositivos vedáveis de duas câmaras para formar modelos ex vivo com dentina infectada, contendo solução tampão na câmara inferior. Os modelos foram inoculados com uma suspensão de E. faecalis V583 ou E. faecalis JH2-2. Após sete dias de incubação a 37°C, adicionou-se ao canal de cada segmento de dentina infectada dos grupos 2 e 5 uma suspensão do fago geneticamente modificado, φEf11/φFL1C(Δ36)PnisA e manteve-se a incubação por mais 72 horas. Os segmentos de dentina foram instrumentados com Gates Glidden e a solução tampão foi aliquotada para semeadura e contagem de UFC e aferição do título residual de células de E. faecalis. Os resultados do primeiro experimento mostraram uma diminuição de 10-100 vezes (p≤ 0,05) das células viáveis (UFC / biofilme) após tratamento com bacteriófago, o que foi consistente com a comparação das imagens de biofilme tratado e não tratado visualizadas com projeções máximas da série Z. No segundo experimento a titulação de E. faecalis verificada após tratamento com o bacteriófago foi reduzida em 18% para os modelos infectados com JH2-2 e em 99% (p≤ 0,05) nos modelos infectados com V583. Com base nesses resultados, pode-se concluir que a biomassa dos biofilmes de E. faecalis, tanto sensíveis quanto resistentes à vancomicina, foi significantemente reduzida após a infecção pelo bacteriófago φEf11/φFL1C(Δ36)PnisA. Além disso, o tratamento da dentina infectada por E. faecalis com bacteriófago φEf11/φFL1C(Δ36)PnisA resultou em diminuição da população bacteriana residual de cepas sensíveis e resistentes à vancomicina, alcançando significância estatística no grupo que utilizou a cepa V583.

Residual microorganisms in the root canal system (RCS) have been identified as the main cause of endodontic therapy failure. The ability to form a biofilm and penetrate the dentin tubules are survival factors that favor the perpetuation of microorganisms within the RCS. Therapies that promote the disorganization of biofilms and elimination of bacteria within the dentinal tubules are essential for endodontic disinfection. A therapy discovered a century ago called Bacteriophage Therapy is based on the use of viruses capable of infecting and killing bacteria. Recently, this antimicrobial approach has been receiving considerable attention since it represents an alternative for the treatment of diseases caused by multiresistant antibiotic bacteria. The aim of this study was to evaluate the efficacy of a genetically engineered bacteriophage, φEf11/φFL1C(Δ36)PnisA, to disrupt biofilms of two Enterococcus faecalis strains: JH2-2 (vancomycin sensitive) and V583 (vancomycin resistant). This study was divided into two separate experiments. In the first experiment, 24 hour static biofilms of E. faecalis strains JH2-2(pMSP3535 nisR/K) and V583(pMSP3535 nisR/K) formed on cover slips were inoculated with bacteriophage φEf11/φFL1C(Δ36)PnisA. After 24 and 48 hours incubation, the bacterial biomass was imaged by confocal microscopy and viable cells were quantified by colony forming unit (CFU) measurement. In the second experiment, extracted human dentin root segments were cemented into sealable two-chamber devices, fabricated from syringe needle caps to form in vitro infected-dentin models. The models were inoculated with an overnight suspension of either E. faecalis V583 (vancomycin resistant strain) or E. faecalis JH2-2 (fusidic acid and rifampin resistant, vancomycin sensitive strain). After 7 days of incubation at 37°C, a suspension of a genetically engineered phage, φEf11/φFL1C(Δ36)PnisA, was added to the root canal of each infected dentin segment, and the incubation was continued for an additional 72-hours. Dentin was harvested from the walls of each root canal and assayed for the residual titer of E. faecalis cells. The results from the first experiment showed a 10-100-fold fewer decrease in viable cells (CFU/biofilm) after bacteriophage treatment, which was consistent with comparisons of treated and untreated biofilm images visualized as max projections of the Z-series. On the second experiment, the recovered E. faecalis titer was reduced by 18% for the JH2-2 infected models, and by 99% for the V583 infected models. These results suggest that the biomass of E. faecalis biofilms, both sensitive and resistant to vancomycin, was significantly reduced after infection by bacteriophage φEf11/φFL1C(Δ36)PnisA. In addition, treatment of E. faecalis-infected dentin with the phage resulted in the decrease of the residual bacterial population for both susceptible and vancomycin resistant strains, reaching statistical significance in strain V583 group.

Virulência e formação de biofilme microbiano por Enterococcus faecalis isolados de swabs cloacais de frangos de corte infectados com Eimeria spp / Virulence and biofilm formation by Enterococcus faecalis isolates from cloacal swabs of broilers infected with Eimeria spp

A dinâmica da microbiota no trato gastrointestinal (TG) de animais pode ser afetada por patógenos, tais como Eimeria spp. Os enterococos são bactérias saprófitas que colonizam o TG de mamíferos e aves. A influência sobre a microbiota intestinal está relacionada com a capacidade de adaptação das bactérias em se aderir às células hospedeiras e de colonizar as células das mucosas. O objetivo deste estudo foi analisar a frequência de genes de virulência ace, agg e operon do bopABCD em Enterococcus faecalis isolados de swabs cloacais de frangos de corte desafiados com Eimeria spp e alimentados com dietas padrões suplementadas ou não com anticoccidiano (monesina) e também avaliar a capacidade dessas cepas em formar biofilmes sob condições in vitro. Um total de 70 E. faecalis foram selecionadas e o gene agg foi mais freqüente em cepas isoladas de frangos de corte alimentados com anticoccidiano (92,3%) quando comparado ao grupo que não recebeu anticoccidiano (70,5%). Por outro lado, os genes ace e do operon bopABCD não demostraram nenhuma diferença significativa entre os dois grupos de frangos (P>0,005). Os E. faecalis isolados de frangos de corte alimentados com anticoccidiano demostraram uma maior frequência de fortes aderentes quando crescendo em meio suplementado com glicose (92,3-88,5%) e urina (77%), quando comparado com enterococos isolados de frangos que não receberam anticoccidiano. Observou-se que E. faecalis isolados de frangos tratados com anticoccidiano mostraram uma maior frequêencia dos genes dos fatores de virulência e de perfil de fortes formadores de biofilme, o que indica uma melhor adaptação dos isolados em ambiente intestinal saudável.

The microbiota dynamics in the gastrointestinal tract (GT) of animals can be disrupted by pathogens, such as Eimeria spp. Enterococci are saprophytic bacteria that colonize the GT of mammals and birds. The influence on the intestinal microbiota is related to the adaptive capacity of bacteria to adhere to host cells and colonize the mucosal cells. The aim of this study was to analyze the frequency of virulence genes ace, agg and bopABCD operon in Enterococcus faecalis isolated from cloacal swabs of broilers challenged with Eimeria spp. and fed with a standard diet supplemented or not with anticoccidial (monensin), and, also to evaluate for the ability of these strains to form biofilms under in vitro conditions. A total of 70 E. faecalis were selected and the agg gene was more frequent in strains isolated from the broilers treated with anticoccidial (92.3%) when compared to the group that not received anticoccidial (70.5%). On the other hand, the ace and bopABCD operon genes showed no significant difference between the two groups of broilers (P>0.005). The E. faecalis isolated from the broilers treated with anticoccidial showed a higher frequency of strong biofilm formation when growing in medium supplemented with glucose (92.3-88.5%) and urine (77%) when compared with enterococci isolated from broilers that not received anticoccidial. It was observed that E. faecalis isolated from broilers treated with anticoccidial showed a higher frequency of virulence factors genes and stronger biofilms formation, indicating better adaptation of the isolates in healthy intestinal environment.

Antimicrobial effect of two endodontic medicaments with different exposure times, and the morphologic alterations caused to Enterococcus faecalis / Efeito antimicrobiano de dois medicamentos endodônticos com diferentes exposições, e as alterações morfológicas causadas a Enterococcus faecalis

PURPOSE: The aim of this study was to verify the antimicrobial effect of calcium hydroxide and iodoform on Enterococcus faecalis with different exposure times evaluating the bacterial morphologic alterations. METHODS: The antibacterial action was investigated in culture broth after zero, seven, fourteen and twenty-one days. Five mL samples were analyzed morphologically on the seventh day by transmission electron microscopy. The data of the antibacterial test were analyzed by Fisher's exact test. RESULTS: The results revealed that between the seventh and fourteenth day, there was a decrease in bacterial growth with both medicaments (P=0.098), where they were eliminated between the fourteenth and twenty-first day. Transmission electronic microscopy showed alterations in the morphologic structures. CONCLUSION: It concluded that both medicaments kill Enterococcus faecalis, with an exposure time of 7 to 14 days, where no cell viability is seen after this period due to irreversible alterations in bacterial cell morphology.

OBJETIVO: O presente estudo verificou o efeito antibacteriano do hidróxido de cálcio e do iodofórmio em Enterococcus faecalis com diferentes tempos de exposição, avaliando as alterações morfológicas bacteriana. MÉTODOS: A ação antibacteriana foi investigada através de caldo de cultura após zero, sete, 14 e 21 dias, e assim, 5 mL das amostras do sétimo dia foram analisadas morfologicamente por microscopia eletrônica de transmissão. Os dados da ação antibacteriana em caldo foram analisados pelo teste Exato de Fisher. RESULTADOS: Os resultados revelaram que entre o 7º e o 14º dia houve diminuição do crescimento bacteriano com ambos os medicamentos (P=0,098), onde a eliminação bacteriana ocorreu entre o 14º e 21º dia. A microscopia eletrônica de transmissão apresentou alterações na estutura morfolófica bacteriana. CONCLUSÃO: Pode-se concluir que ambos os medicamentos destroem o Enterococcus faecalis com tempo de exposição de 7 a 14 dias, onde a viabilidade celular não é observada após este período devido alterações irreversíveis na morfologia celular bacteriana.