Frequency of first and second-line drug resistance-associated mutations among resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from São Paulo, Brazil

BACKGROUND Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis, and the number of new cases of multidrug resistant TB (MDR-TB), pre extensively drug-resistant TB (pre-XDR-TB) and extensively drug-resistant TB (XDR-TB) has increased considerably worldwide. OBJECTIVES Herein, using 156 M. tuberculosis isolates from 106 patients previously classified as MDR or pre-XDR or XDR isolates, we investigated the genetic mutation profiles associated with phenotypic resistances in patients with MDR-TB, pre-XDR-TB and XDR-TB, treatment outcomes and resistance evolution. METHODS Molecular analyses were performed by partial sequencing of the rpoB, katG, gyrA, gyrB, rrs genes and analysis of the fabG-inhA promoter region. Clinical, epidemiologic and demographic data were obtained from the TB Notification database system of São Paulo (TB-WEB) and the Information System for Special Tuberculosis Treatments (SITE-TB). FINDINGS Drug resistance was attributed to previously known mutations and a novel Asp449Val mutation in gyrB was observed in four isolates from the same patient. Ten patients had more than one isolate evaluated and eight of these patients displayed resistance progression. MAIN CONCLUSIONS The present study is the first to report the frequency of mutations related to second-line drug resistance in MDR-TB, pre-XDR-TB and XDR-TB isolates. The results could lead to the improvement of available technologies for the rapid detection of drug resistant TB.

Mutações no gene nat de isolados de Mycobacterium tuberculosis: efeito na atividade enzimática e no perfil de resistência à isoniazida / Mutation in the nat gene of Mycobacterium tuberculosis strains: effect on the enzymatic activity and on the isoniazid-resistance profile

Como entre 25%-50% dos isolados de Mycobacterium tuberculosis resistentes à INH não apresentam mutações nos genes katG, inhA, ahpC e kasA que possam justificar sua resistência, foi proposta a influência de mutações específicas no gene nat nos mecanismos de resistência e atividade da NAT. Todos os isolados obtidos (n=125) foram identificados e caracterizados através da amplificação pela PCR da IS6110 e por MIRU-VNTR, respectivamente. A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi realizada pelo método REMA. Após triagem de mutações nos genes caracteristicamente envolvidos com resistência pela PCR-SSCP, seguida de seqüenciamento de DNA, foram selecionados 45 isolados para o estudo de mutações específicas (pela PCR e sequenciamento) e expressão gênica do mRNA do gene nat através da RT-PCR em tempo real. Confirmou-se que mutação no gene katG é a mais correlacionada com a resistência à INH, pois 68,4% das cepas resistentes apresentaram mutação neste gene. Mutações na região promotora do gene inhA, na região intergênica oxyR-ahpC e no gene kasA foram encontradas em 8,8%, 5,6% e 21,6% dos isolados, respectivamente...

Tubersulose: da resistência genômica à isoniazida e à rifampicina ao paciente com multirresistência / Tubersulosis: genomic resistance to isoniazid and rifampicin to patient with multiresistance

A tuberculose (TB) é a principal causa de morte no mundo, por um agente infeccioso único. Atualmente, o maior problema global da TB é o aumento gradual de cepas multirresistentes (resistência pelo menos à isoniazida e à rifampicina) do Mycobacterium tuberculosis (Mtb), pela dificuldade do tratamento que produz. Os dois objetivos iniciais deste trabalho foram: 1. Analisar os tipos de mutação que ocorrem em duas regiões iniciais do gene katG do Mtb, locais de maior frequência de mutações que causam resistência à isoniazida (INH) e 2. Determinar os tipos e frequências das mutações no gene rpoB que produzem resistência à rifampicina (RMP). As culturas, na grande maioria multirresistentes (MR), e os respectivos DNAs, foram fornecidos pelo Centre de Referência Professor Helio Fraga (FIOCRUZ). Duas regiões do gene katG, a primeira do códon 1 até o códon 119, e a segunda, do códon 267 até o códon 504, e a região entre os códons 445 e 560 do gene rpoB foram amplificadas por PCR e os produtos sequenciados, para o diagnóstico de mutações, que ocorreram nas cepas resistentes. Para a análise do gene katG foram utilizadas 101 cepas, conforme a disponibilidade. Na região 1 houve 30 casos de mutação, sendo 24 por deleção de um nucleotídeo no códon 4. Na região 2 ocorreram 80 mutações pontuais, sendo 73 no códon 315, a maioria de Serina AGC para Treonina ACC. Considerando as duas regiões o diagnóstico de resistência foi possível em 87,1% das 101 cepas. Na análise do gene rpoB usamos 120 cepas de Mtb e na região delimitada ocorreram 118 mutações em 107 cepas, sendo a maioria nos códons 531 (45.6%), 526 (26%) e 516 (12.5%). Nosso terceiro objetivo foi determinar as características clínicas e a evolução de 50 pacientes do Estado do Rio de Janeiro, com tuberculose pulmonar (pela facilidade de obtenção dos dados), infectados com os bacilos multirresistentes que estudamos anteriormente. A partir das culturas de escarro os doentes foram identificados e os dados clínicos...

Tuberculosis (TB) is the main cause of death in the world due to a single infectious pathogenic agent. Nowadays, one of the most serious global problems related to this disease is the increase in the occurrence of multidrug resistant (MDR) M. tubersulosis strains, resistant to isoniazid and rifampicin, and their treatment. Firstly, there are two early aims to objectives in the first part of this thesis: 1 - To analyze and compare the types kind of mutations in two different regions of the KatG gene, the usual region for responsible for isoniazid resistance; and 2 - To determine and compare the type and frequency of rpoB gene mutations envolved in the rifampicin resistance. The cultures, almost of all MDR, and their respectively DNA, were provided by Centro de Referência Professor Helio Fraga (FIOCRUZ). Two regions of the katG gene (gene bank U06252), the first going from codon 1 up to codon 119 and the second one, from codon 267 to codon 504, were amplified by PCR, and sequenced to identify the mutations. The analyses were done in 101 Mycobacterium tuberculosis sputum cultures from Centro de Referência Prof. Helio Fraga. To analyse of the KatG gene, were considered 101 TB sputum cultures were considered. Thirty cases had mutations in region 1, being 24 cases by deletions at codon 4. Region 2 showed 80 point mutations, especially at codon 315, where, in 73 cases changed Serine AGC was changed to Threonine ACC. Regarding both regions the diagnosis of resistance occurred in 87.1% of the 101 strains. The analyses of the rpoB gene was done with 120 TB strains, and 118 mutations were detected in 107 isolates, being the majority at codons 531 (45.6%), 526 (26%) and 516 (12.5%). The third aim was to determine the clinical features and evolution of 50 patients with multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in the lung (TBMDR) from State of Rio de Janeiro. The sputum cultures to MDRTB, clinical data were obtained from Braziliam Ministry of Health MDRTB database...