Comparative study of direct and indirect immunofluorescence for diagnosis of canine pemphigus foliaceus / Estudo comparativo da imunofluorescência direta e indireta para o diagnóstico do pênfigo foliáceo canino

Pemphigus foliaceus (PF) is the most common autoimmune skin disease in dogs. It is characterized by pustules, erosions, and crusts which occur due to the presence of autoantibodies that target intercellular adhesion. Histopathological examination is considered the gold standard pattern in the diagnosis, but may sometimes be inconclusive, especially when the characteristic findings are not identified. New diagnostic tests are continuously being developed and immunofluorescence assays, could be a valuable alternative diagnostic tool. This study aimed to evaluate the applicability of direct and indirect immunofluorescence (DIF and IIF) tests for the diagnosis of canine PF. Twenty eight dogs were divided into two groups: Group I with 14 dogs with PF and Group II (control) with 14 dogs with Superficial pyoderma (differential diagnoses of PF). All animals were submitted to skin biopsy to histopathological and DIF. Blood samples were collected to assess IIF. Comparing the DIF results against the histopathology test, there was an agreement of 75% (9/12) with a Kappa index of 0.77 (P<0.001). Considering IIF, the agreement was 100% (14/14), with a Kappa index of 1.0 (P<0.001). We conclude that DIF and IIF are highly effective and were useful and effective complementary examination tests for an improvement in the diagnosis of canine PF.(AU)

O pênfigo foliáceo (PF) é considerado uma das doenças tegumentares autoimunes mais frequentes em cães. Clinicamente, caracteriza-se pela presença de pústulas, erosões e crostas. O exame histopatológico é considerado o teste diagnóstico de eleição, porém pode se mostrar inconclusivo, sobretudo quando os achados característicos da doença não são observados. Novas ferramentas diagnósticas têm sido desenvolvidas e os testes de imunofluorecência são uma valiosa alternativa. Este estudo teve como objetivo avaliar a aplicabilidade das reações de imunofluorescência direta (IFD) e indireta (IFI) para o diagnóstico do PF canino. Vinte e oito cães foram divididos em dois grupos: grupo I com 14 cães com PF e grupo II (controle) com 14 cães com piodermite superficial (um dos principais diagnósticos diferenciais do PF). Todos os animais foram submetidos à biópsia cutânea, seguida de exame histopatológico e IFD. Amostras de sangue foram coletadas para realização da IFI. Comparando-se os valores de IFD com o histopatológico, obtiveram-se valores de concordância de 75% (9/12), com índice Kappa de 0,77 (P<0,001). Já na IFI, a concordância foi de 100% (14/14), com índice Kappa de 1,0 (P<0,001). Concluiu-se, então, que a IFD e a IFI apresentaram excelentes resultados e podem ser consideradas novas alternativas diagnósticas do PF canino.(AU)

Análise do comportamento das linhagens celulares SCC-25, SAS e HSC-3 frente à presença dos exossomos derivados dos macrófagos (TAMs) dos subtipos M1 e M2 / Analysis of the behavior of cell lines SCC-25, SAS and HSC-3 against the presence of exosomes derived from macrophages (TAMs) of subtypes M1 and M2

O carcinoma epidermóide (CE) de língua representa uma das lesões malignas mais comuns em cavidade oral e caracteriza-se por apresentar um comportamento localmente invasivo e agressivo. Os exossomos são responsáveis pela comunicação célula-célula e podem influenciar na progressão tumoral, metástase e eficácia terapêutica. Dentre as células capazes de secretar exossomos estão as células tumorais e as células imunes. Sabe-se que a presença das células imunes é importante para erradicar os tumores. No entanto, achados recentes demonstram que a inflamação pode promover o crescimento tumoral. Os macrófagos associados a tumores (TAMs) são conhecidos por apresentarem diferentes subtipos, M1 e M2, capazes de secretarem exossomos. O presente estudo se propôs a observar o comportamento dos exossomos derivados dos TAMs, dos subtipos 1 e 2, frente a cultura de células humanas SCC-25, HSC-3 e SAS derivadas de CE de língua, por meio da análise da capacidade de invasão, proliferação e viabilidade das células tumorais na presença dos exossomos. Observou-se que as microvesículas derivadas dos TAMs apresentam positividade para CD63, caracterizando-as como exossomos. Os exossomos dos TAMs do subtipo M2 foram os únicos a apresentarem marcação para TGF-ß, quando em comparação com os exossomos M1, THP1 e das linhagens celulares de CE, sugerindo que os exossomos M2 podem ser responsáveis pela expressão de TGF-ß nas células tumorais, uma vez que são internalizados. Nos ensaios de migração, observou-se que as células SCC-25 em presença de meio de cultura DMEM F/12, apresentaram maior capacidade de invasão frente aos exossomos M2 (p≤0,001), para concentração de 0,1 µg/ml. Para as células HSC-3 e SAS, não foi observada relação estatisticamente significante entre a presença de exossomos cultivados juntamente com as células tumorais e a capacidade de invasão celular (p>0,05). Quando os exossomos foram colocados no compartimento inferior do transwell, as células HSC-3 em presença dos exossomos M2 (1,0 µg/ml) apresentaram maior capacidade de invasão (p≤0,001). O teste de viabilidade demonstrou que as células HSC-3 tornam-se mais viáveis frente à presença dos exossomos M2 (p≤0,001) na concentração de 50 µg/ml. Para as células SCC-25, o resultado foi o mesmo (p≤0,05). A imunofluorescência demonstrou a internalização dos exossomos nas linhagens celulares estudadas. Os achados sugerem que a presença de exossomos M2, frente às culturas de células de CE de língua, pode ser um campo de pesquisa importante para futuros estudos com terapias-alvo (AU).

Squamous cell carcinoma (SCC) of the oral tongue is one of the most common malignant lesions in the oral cavity and is characterized by presenting a locally invasive and aggressive behavior. The exosomes are responsible for cell-cell communication and may influence tumor progression, metastasis and therapeutic efficacy. Among the cells that can secrete exosomes are tumor cells and immune cells. It is known that the presence of immune cells is important to eradicate tumors. However, recent findings suggest that inflammation may promote tumor growth. The tumor associated macrophages (TAMs) are known to have subtypes, M1 and M2, that secrete exosomes. This study's goal was to observe the behavior of derivatives TAMs exosomes, subtypes 1 and 2, against human cell culture SCC-25, HSC-3 and SAS derived from SCC of oral tongue, through the analysis of invasiveness, proliferation and viability of tumor cells in the presence of exosomes. It was observed that the microvesicles derived from TAMs are positive for CD63, characterizing them as exosomes. The exosomes of the M2 subtype TAMs were the only ones to present TGF-ß marking, as compared with M1 exosomes, THP1 and SCC cell lines, suggesting that M2 exosomes may be responsible for TGF-ß expression in tumor cells. In the migration tests, it was found that the SCC-25 cells in the presence of culture medium DMEM F / 12 showed higher invasion capacity in the presence of M2 exosomes (p≤0,001) to a concentration of 0.1 µg/ml. For HSC-3 and SAS cells, there was no significant statistical relationship between the presence of exosomes and invasiveness (p> 0.05) for the exosomes derived from TAMs. When the exosomes were placed in the lower compartment of the transwell, the HSC-3 cells in the presence of M2 exosomes (1.0 µg/ml) had higher invasiveness (p≤0,001). The viability test showed that HSC-3 cells became more viable in the presence of M2 exosomes (p≤0.001) at a concentration of 50 µg/ml. For SCC-25 cells, the result was the same (p≤0.05). Immunofluorescence showed the internalization of exosomes in the cell lines studied. These findings suggest that the presence of M2 exosomes in the SCC of the oral tongue cell cultures may be an important research field for future studies of targeted therapies (AU).

Avaliação de marcadores de prognóstico no câncer de mama e análise funcional de CIP4 / Evaluation of prognostic markers in breast cancer and functional analysis of CIP4

O câncer de mama é uma doença extremamente heterogênea compreendendo diferentes subtipos moleculares que resultam em evoluções clínicas e condutas terapêuticas distintas. A maior gravidade desta patologia está associada a sua capacidade de formação de metástases Mudanças no padrão de expressão gênica têm sido associadas à manifestação do fenótipo metastático. Neste trabalho, utilizamos microarranjos de tecido (TMAs) para investigar a expressão de 8 biomarcadores candidatos (CIP4, PPIL1, ITGAV, AKAP14, MICA, FXYD1, ARPC3, ABG1) e avaliar seu potencial prognóstico em pacientes com carcinoma ductal invasivo da mama. Destes, ARPC3 PPIL1 e CIP4 mostraram associações estatisticamente significativas com a sobrevida câncer específica e/ou a probabilidade de desenvolvimento de metástases. Determinamos que a expressão aumentada de CIP4 nos tumores está associada a maior probabilidade de desenvolvimento de metástases. CIP4 é uma proteína adaptadora descrita na literatura como moduladora de migração e invasão celular e portanto selecionamos este candidato para caracterização funcional detalhada. Observamos que a expressão de CIP4 encontra-se aumentada em linhagens tumorais com características invasivas. A partir do silenciamento estável e regulado de CIP4 na linhagem metastática MDA-MB-231, determinamos que CIP4 modula positivamente a ativação de MAPK-p38 e a expressão de MMP2 , sugerindo que CIP4 participe em vias de sinalização importantes para a transição epitélio-mesenquima (EMT). O silenciamento de CIP4 resultou em uma redução de aproximadamente 50% da capacidade migratória e invasiva das células tumorais in vitro , e na diminuição da formação de metástases pulmonares in vivo. Coletivamente, nossos resultados indicam que CIP4 tem potencial como marcador de prognóstico assim como um possível alvo terapêutico no controle da disseminação de metástases nos tumores da mama

Breast cancer is an extremely heterogeneous disease comprising different molecular subtypes that result in different clinical outcomes and therapeutic procedures. The severity of this disease is mainly associated with its ability to produce metastasis. Changes in gene expression profile have been associated with the manifestation of the metastatic phenotype. In this study, we used tissue microarrays (TMAs) to investigate the expression of 8 candidate biomarkers (CIP4, PPIL1, ITGAV, AKAP14, MICA, FXYD1, ARPC3 e ABG1) and to evaluate their prognostic potential in patients with invasive ductal breast carcinoma. Among these, ARPC3, PPIL1 and CIP4 showed statistically significant associations with cancer specific survival and/or the patient's probability to develop metastasis. We found that increased expression of CIP4 in tumors is associated with a higher probability of developing metastasis. CIP4 is an adaptor protein described in the literature as a modulator of cell migration and invasion and therefore we selected this candidate for detailed functional characterization. We observed that CIP4 expression is increased in tumor cell lines with invasive characteristics. Following the stable and regulated knockdown of CIP4 in the metastatic line MDA-MB-231, we determined that it modulates positively the activation of MAPK-p38 and the expression of MMP2, suggesting that CIP4 participates in important signaling pathways required for the epithelial mesenchymal transition (EMT). CIP4 silencing resulted in an approximate 50% reduction of the migratory and invasive capacity of tumor cells in vitro and decreased the generation of lung metastases in vivo. Collectively, our results indicate that CIP4 has potential as a prognostic marker as well as a potential therapeutic target to control the metastatic dissemination of breast tumors

Identificação de adesinas de Leptospira interrogans por shotgun phage display / Identification of Leptospira interrogans adhesins by shotgun phage display

Em Leptospira interrogans algumas proteínas com capacidade de ligação aos componentes de matriz extracelular foram identificadas e, em sua maioria, são fatores de virulência. Phage display é considerada uma técnica poderosa na identificação de novos ligantes, inclusive de moléculas adesinas, importantes no primeiro estágio de infecção do hospedeiro. A técnica de shotgun phage display foi utilizada visando à obtenção de ligantes à células de mamíferos. Quatro bibliotecas, por inserção de fragmentos aleatórios obtidos por sonicação do DNA de L. interrogans nos fagomídeos pG8SAET (BBT1 e BBT2) e pG3DSS (BBT5 e BBT6), foram construídas. As bibliotecas BBT1 e BBT5 contém insertos maiores e as BBT2 e BBT6 contém insertos menores, com tamanhos médios de 1500 pb e 350 pb, respectivamente. Após ensaio de panning da BBT5 contra células de mamíferos e soro fetal bovino, as sequências de clones selecionados foram analisadas quanto a orientação correta e se a fusão estava em fase com a proteína pIII. As proteínas codificadas pelos genes LIC11719, LIC10769, LIC13143 e LIC12976 foram selecionadas com estas características. Os genes que codificam a LIC12976, LIC10768, LIC10769 e LIC13418, tiveram sua conservação avaliada em diferentes sorovares da espécie patogênica L. interrogans e no sorovar Patoc da espécie de vida livre L. biflexa. As proteínas LIC12976 (selecionada pela técnica de phage display) e LIC13418 (selecionada por ferramentas de bioinformática) tiveram suas sequências amplificadas por PCR, clonadas em pGEM T easy, subclonadas em vetor de expressão pAE e expressas na fração celular correspondente ao corpúsculo de inclusão em E. coli BL21 (DE3) Star pLysS e E. coli BL21 SI, respectivamente. Após renaturação e purificação destas proteínas por cromatografia de afinidade a metal bivalente, um grupo de cinco animais BALB/c fêmeas foi imunizado. Ambas as proteínas se mostraram imunogênicas com títulos dos soros policlonais 1:256000 e 1:512000, respectivamente. Em ensaio de Western Blot os soros foram específicos no reconhecimento das proteínas recombinantes e as proteínas nativas foram verificadas em extratos de sorovares patogênicos de L. interrogans. Em ensaios de adesão, as proteínas recombinantes aderiram às células A31, LLC-PK1 e Vero e especificamente à laminina. Em ensaios de interferência em células usando laminina houve um aumento da adesão das proteínas recombinantes, o que pode ser explicado pela ligação da laminina às células e uma maior ligação das LICs estudadas. Em ensaio de localização celular usando imunofluorescência e microscopia eletrônica, foi observado que ambas as proteínas se encontram na superfície da L. interrogans. No experimento de desafio animal, a LIC12976 e a LIC13418 não se mostraram protetoras. Este trabalho contribuiu para a identificação das novas adesinas LIC13418 e LIC12976 que podem participar da virulência de leptospiras patogênicas envolvendo a primeira etapa da infecção na interação patógeno-hospedeiro

In Leptospira interrogans, proteins capable to bind to extracellular matrix components have been identified and most of them are important virulence factors. Phage display is a powerful technique to identify new ligands, including adhesin molecules that are important in the first stage of host infection. A shotgun phage display technique was used in order to obtain cell ligands. Four libraries were constructed by inserting random fragments obtained by sonication of L. interrogans DNA into phagemids pG8SAET (BBT1 and BBT2) and pG3DSS (BBT5 and BBT6). The libraries BBT1 and BBT5 contain larger inserts and BBT2 and BBT6 contain smaller inserts, with 1500 bp and 350 bp average sizes, respectively. After panning of BBT5 against mammalian cells and bovine fetal serum, the sequences of selected clones were analyzed for correct orientation and fusion with pIII protein. The proteins encoded by genes LIC11719, LIC10769, LIC13143 and LIC12976 were selected. The genes LIC12976, LIC10768, LIC10769 and LIC13418 were evaluated for their conservation in different pathogenic serovars of L. interrogans and free-living L. biflexa serovar Patoc. Proteins LIC12976 (selected by phage display technique) and also LIC13418 that was selected by bioinformatic tools, were amplified by PCR, cloned into pGEM T easy, subcloned into expression vector pAE and expressed in cellular fraction corresponding to the inclusion body in E. coli BL21 (DE3) Star pLysS and E. coli BL21 SI, respectively. After protein renaturation protocol and purification by affinity chromatography, a group of five BALB/c mice was immunized with the purified proteins. Both proteins were shown to be immunogenic with 1:256000 and 1:512000 polyclonal sera titers, respectively. In Western blot the sera were specific to recognize recombinant proteins and native proteins were detected in pathogenic L. interrogans serovars extracts. In binding assays, recombinant proteins bind to A31, LLC-PK1 and Vero cells and specifically to laminin. In interference cell assay using laminin there was an increase of recombinant protein bindings, which can be explained by the laminin binding to cells and further binding of the recombinant LICs. In cellular localization assay using immunofluorescence and electron microscopy, it was observed that both are surface proteins of L. interrogans. In the animal challenge, the LIC12976 and LIC13418 were not protective. As a whole, this work contributed to the identification of LIC12976 and LIC13418 as new adhesins and they can participate in the virulence of pathogenic Leptospira in the first stage of host pathogen interaction.

Granuloma facial: Hallazgos de inmunofluorescencia directa en cuatro casos / Facial Granuloma

El granuloma facial es una entidad clínica e histológica bien definida, cuya etiología permanece desconocida. Los hallazgos por inmunofluorescencia directa de depósitos de inmunoglobulinas y complemento en las lesiones, inician un nuevo camino de investigación que aún no ha sido bien aclarado, ya que se alternan estudios positivos con otros megativos. Estudiamos 4 pacientes, 3 hombres y una mujer, con un rango de edad de 33 a 55 años; el tiempo de evolución de la enfermedad osciló entre 1 y 14 años. Todos los pacientes tenían compromiso facial. Uno presentó lesiones múltiples y otro se acompañaba de lesiones extrafaciales. La inmunofluorescencia directa fue positiva en dos casos, hallando depósitos granulares de IgA en zona de membrana basal. La IgG, IgM, IgE y complemento fueron negativos en los 4 casos. Las distintas características de las inmunoglobulinas más un factor ambiental (rayos ultravioletas) u otro, llevaría a la IgA de la circulación a los tejidos. Posteriormente lo haría la IgG en la respuesta secundaria

Relación entre anticuerpos circulantes y cantidad de Candida albicans en materia fecal / Relation betwen circulatory antibodies and quality of candida albicans in faecal materia

Se estudió la presencia de anticuerpos contra Candida albicans, en 42 pacientes a los cuales se solicitaba cultivo micológico y recuento de levaduras en materia fecal. Por métodos estandarizados se procesaron las muestras, se cuantificó la presencia de levadura por gramo de materia fecal y se identificó a Candida albicans. Se obtuvo suero de los pacientes en el momento de llevar las muestras de heces al laboratorio. La presencia de anticuerpos se determinó por tres técnicas serológicas: aglutinación en tubo, inmunodifusión en gel de agar e inmunofluorescencia indirecta frente a levaduras y a tubos germinativos. La correlación de las tres pruebas con los resultados de los cultivos y recuento de colonias fue determinada sólo después que todos los datos fueron acumulados. Los resultados muestran que no existe correlación entre la cantidad de levaduras presentes y los anticuerpos circulantes. Ninguno de los pacientes presentaba infección diseminada o superficial evidente; se tuvo como referencia, la colonización del hongo en intestino

Técnica de inmunofluorescencia para HIV-1 en un Centro de Referencia de la provincia de Buenos Aires / Immunofluorencence technique for HIV-1 at a Reference Center of Buenos Aires province (Argentina)

Se comprobó que la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) con células H9, puede usarse como método confirmatorio para muestras repetidamente reactivas por pruebas de screening (enzimoinmunoensayo). Se evaluaron 99 sueros por IFI según la técnica del Centro Nacional de Referencia para Diagnóstico e Investigación del SIDA, que previamente habían sido seleccionados contra el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) y confirmados por la técnica de Western Blot (WB). Se incluyeron 4 sueros con screening discordante, 2 con valor de corte bajo respecto del cutoff y 1 con screening negativo. Los sueros eran de pacientes de alto riesgo: drogadictos endovenosos 60; homosexuales 5; bisexuales 5; promiscuos 1; heterosexuales en contacto con HIV positivos 7; niños hijos de HIV positivos 6; transfundidos 2 y no refieren datos 13. Por técnica de WB resultaron positivos 89 sueros (89.9%), indeterminados 7 (7.1%) y negativos 3 (3.0%). Por IFI resultaron positivos 79 sueros (79.8%),inespecíficos 2 (2.9%), indeterminados 4 (4.0%) y negativos 14 (14.1%). Un suero positivo por IFI resultó indeterminado por WB. Se hicieron controles positivos y negativos no presentando falsa reactividad. La coincidencia entre ambos métodos fue del 86%. El objetivo fue dar una medida del poder predictivo de IFI como predictor de WB. Se utilizó el criterio Lambda de Goodman-Kruskal, que mide cuánto disminuye el porcentaje de error cuando se usa IFI como predictor de WB, comparado con el predictor consistente en asignar a todos los casos el resultado positivo. Para los datos disponibles se obtiene Lambda = 0.69

Rapid laboratory diagnosis of Campylobacter infection using Immunofluorescent Antibody Technique [IFAT]

Comparison was made between the direct Immunofluorescent antibody technique [IFAT] and the conventional bacteriological procedures in the laboratory diagnosis of campylobacteriosis. The IFAT test was more sensitive and rapid than the culturing procedure in detection of campylobacter microorganisms in clinical specimens. However, the IFAT diagnosis was more reliable on the genus level rather than on species level due to the cross-reactivity between various species

Reaçöes de imunofluorescência indireta e de ELISA na detecçäo de anticorpos IgG e IgM, no soro de pacientes portadores de retinocoroidite ativa e cicatrizada supostamente toxoplásmica / Indirect imunofluorescence reactions and ELISA in detection of IgG and IgM antibodies in the serum of patients having active or healed retinochoroiditis assumed to be toxoplasmic

Este estudo baseia-se em 2 grupos: grupo-caso, constituido de 40 pacientes e grupo-controle de 18 pacientes. O grupo-caso corresponde a pacientes, portadores de lesöes de retinocoroidite ativa, supostamente toxoplasmática, enquanto que o grupo-controle é constituido de pacientes, com lesöes de retinocoroidites cicatrizadas, supostamente toxoplásmicas. Em ambos os grupos, foi estudado o soro dos pacientes para a detecçäo de anticorpos anti-T-gondii (IgG e IgM) nas técnicas de reaçäo de Imunofluorescência indireta e reaçäo imunoenzimática (ELISA). Os resultados obtidos revelam que ambas as técnicas, possuem a mesma sensibilidade e especificidade e que, a incidência de anticorpos IgM no grupo-caso para ELISA, foi de 12,5// e no grupo controle de 11,2

Frecuencia de linfocitos portadores de IgE en pacientes atopicos / Frequency of IgE on the B-Lymphocytes of the atopic patients

Empleando la tecnica de inmunofluorescencia directa se estudio la presencia de receptores de tipo IgE en la membrana de los linfocitos de 30 pacientes atopicos comparativamente con un grupo control constituido por 37 personas. Los resultados mostraron que el grupo atopico presenta un porcentaje de linfocitos de 9,63 mas o menos 2,66 que portan tal receptor frente el 1.77 mas o menos 0,37 presentado por el grupo control. Como hecho interesante se encontro una disminucion estadisticamente significativa para receptores IgM en atopicos, en cambio no hubo diferencia para IgA. La cuantificacion serica de IgE e IgA mostro un aumento para IgE y una disminucion para IgA