Sheep polyclonal antibody to map Haemonchus contortus mimotopes using phage display library / Anticorpo policlonal de ovinos para mapear mimetopos de Haemonchus contortus usando a biblioteca de Phage display

Abstract The aim of this study was to evaluate phage display technology for mapping Haemonchus contortus mimotopes. We screened the PhD-7 Phage Display Peptide Library Kit with a sheep polyclonal antibody against H. contortus. After four rounds of selection, 50 phage peptide clones were selected by biopanning and sequenced. Two clones displaying peptide mimotopes of H. contortus proteins were chosen for sheep immunization: clone 6 - mimotope of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and clone 17 - mimotope of a disorganized muscle family member (Dim 1). Twelve sheep were allocated into 3 groups of 4 animals as follow: G1: control group; G2/GAPDH: immunized with clone 6; and G3/Dim1: immunized with clone 17. Four immunizations were performed at intervals of seven days (0, 7, 14, and 21 days). On day 28 post initial vaccination, all groups were orally challenged with 2500 H. contortus infective larvae. The mimotope peptides selected by phage display were recognized by IgG from sheep naturaly infected with H. contortus. The immunization protocol showed an increasein IgG anti-M13 phage titers, but no effect was observed in IgG-specific for the anti-mimotope peptides. This is the first report of successful use of a phage display library for the identification of mimotopes of H. contortus proteins.

Resumo O objetivo deste estudo foi avaliar a tecnologia de phage display no mapeamento de mimetopos de Haemonchus contortus. Anticorpo policlonal de ovinos anti-H. contortus foi usado para seleção a partir da biblioteca PhD-7 Phage Display Peptide Library Kit (New England BioLabs). Após quatro rodadas, 50 clones de fagos expressando peptídeos foram selecionados e sequenciados. Dois clones que exibiram mimetopos de H. contortus foram escolhidos para imunização de ovinos: clone 6 - mimetopo de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e clone 17 - mimetopo da família do músculo desorganizado (Dim 1). Doze ovinos foram alocados em 3 grupos de 4 animais, da seguinte forma: G1: grupo controle, G2/GAPDH: imunizado com o clone 6 e G3/Dim1: imunizado com o clone 17. Quatro imunizações foram realizadas (0, 7, 14 e 21 dias). No dia 28 após a primeira imunização, todos os grupos foram desafiados oralmente com 2500 larvas infectantes de H. contortus . Os peptídeos mimetopos selecionados foram reconhecidos por IgG de ovinos naturalmente infectados por H. contortus. O ensaio de imunização revelou um aument dos títulos de IgG anti-fago M13, mas não ocorreu aumento de IgG anti-peptídeos mimetopos. Este é o primeiro relato de uso bem sucedido da biblioteca de Phage display para a identificação de mimetopos de H. contortus.

Frequency of benzimidazole resistance in Haemonchus contortus populations isolated from buffalo, goat and sheep herds / Frequência da resistência ao benzimidazol em populações de Haemonchus contortus isoladas de rebanhos de bubalinos, caprinos e ovinos

Anthelmintic resistance is an increasing problem that threatens livestock production worldwide. Understanding of the genetic basis of benzimidazole resistance recently allowed the development of promising molecular diagnostic tools. In this study, isolates of Haemonchus contortus obtained from goats, sheep and buffaloes raised in Brazil were screened for presence of the polymorphism Phe200Tyr in the β-tubulin 1 gene, which confers resistance to benzimidazole. The allelic frequency of the mutation conferring resistance ranged from 7% to 43%, and indicated that resistance to benzimidazole could be found in nematodes isolated from all the ruminant species surveyed. Although significant variation in the frequency of the F200Y mutation was observed between different herds or host species, no significant variation could be found in populations isolated from animals within the same herd. These findings suggest that screening of samples from a few animals has the potential to provide information about the benzimidazole resistance status of the entire herd, which would enable a considerable reduction in the costs of diagnosis for the producer. Molecular diagnosis has practical advantages, since it can guide the choice of anthelmintic drug that will be used, before its application in the herd, thus reducing the economic losses driven by anthelmintic resistance.

A resistência aos anti-helmínticos é um problema crescente que ameaça a produção pecuária em todo o mundo. A compreensão da base genética da resistência ao benzimidazol permitiu, recentemente, o desenvolvimento de métodos diagnósticos moleculares promissores. Neste estudo, isolados de Haemonchus contortus obtidos a partir de rebanhos de caprinos, ovinos e bubalinos criados no Brasil foram avaliados quanto à presença do polimorfismo F200Y no gene da β-tubulina1, o qual confere resistência ao benzimidazol. A frequência alélica da mutação variou de 7% a 43%, indicando que a resistência ao benzimidazol pode ser encontrada em nematoides isolados a partir de todas as espécies de ruminantes pesquisadas. Embora tenha sido observada variação significativa das frequências de mutação F200Y entre rebanhos/espécies hospedeiros distintos, não foi encontrada variação significativa entre populações isoladas de animais dentro de um mesmo rebanho. Estes achados sugerem que a avaliação de amostras de alguns poucos animais tem o potencial de fornecer informações sobre o nível de resistência ao benzimidazol de todo o rebanho, possibilitando uma redução considerável dos custos de diagnóstico para o produtor. O diagnóstico molecular apresenta vantagens práticas, uma vez que pode guiar a escolha da base anti-helmíntica a ser utilizada antes da sua aplicação no rebanho, reduzindo, portanto, as perdas ocasionadas pela resistência aos fármacos anti-helmínticos.