Método imunomagnético associado ao meio MesenCult® na obtenção de células mononucleares da medula óssea de coelhos negativas para o anticorpo monoclonal CD45 / Immunomagnetic method associated with MesenCult® medium to obtain bone marrow mononuclear cells from rabbits negative for CD45 monoclonal antibody

O objetivo detse artigo é de descrever um protocolo de isolamento das células mononucleares da medula óssea de coelhos, seguido de purificação celular por depleção negativa com o anticorpo monoclonal CD45 e posterior expansão em meio de cultura MesenCult®. Dez coelhos machos adultos, da raça Nova Zelândia, com idade média de 1,0±0,2 anos e peso médio 3,5±0,24kg, foram utilizados para padronização da metodologia. O isolamento das células mononuclares da medula óssea foi realizado pelo gradiente de densidade Ficoll-paque® e a purificação e obtenção das células- pela depleção negativa com o anticorpo monoclonal CD45 em base imunomagnética. A população celular obtida foi expandida posteriormente em meio de cultura MesenCult®. No isolamento pelo gradiente de icoll-Paque® foi obtido um rendimento médio de 7,31x106 células/mL. Após purificação e obtenção das possíveis células-tronco mesenquimais pela base imunomagnética, houve um decréscimo do rendimento para 2,28x106 células/mL, mas o processo de expansão foi incrementado pelo cultivo celular. Os resultados indicaram que as células obtidas da fração mononuclear da medula óssea, cultivadas in vitro foram capazes de gerar células aderentes 24 horas após o cultivo, com predominância de células fibroblastóides sugestivas de células-tronco mesenquimais. Concluiu-se que a obtenção de células-tronco mesenquimais pode ser alcançada após purificação das células mononucleares da medula óssea de coelhos pelo método imunomagético, o meio de cultura MesenCult® proporciona um ambiente adequado para a rápida expansão in vitro e o número de passagens exerce influência negativa sobre as características morfológicas das células.

The objective of this study was to describe guidelines for the isolation of bone marrow mononuclear cells from rabbits, followed by cell purification by negative depletion with CD45 monoclonal antibody, and further expansion in MesenCult® medium. Ten adult male New Zealand White rabbits, age average of 1.0±0.2 years and weighting 3.5±0.24kg, were used to obtain a standardized method. The mononuclear cells of the bone marrow were isolated with Ficoll-paque® density gradient centrifugation, and the cell purification and acquisition was completed by negative depletion with CD45 monoclonal antibody in immunomagnetic base. The cell population obtained was expanded in MesenCult® medium. Through isolation with Ficoll-paque® density gradient was possible to obtain an average yield of 7.31x106 cells/mL. After purification and acquisiton of potential mesenchymal stem cells by the immunomagnetic base, there was a yield decrease to 2.28x106 cells/mL; however the expansion process was increased in cell culture. The results indicated that cells obtained from the mononuclear fraction of bone marrow and cultivated in vitro were capable to generate adherent cells 24 hours after culture, with predominance of fibroblastoid cells suggestive of mesenchymal stem cells. It can be concluded that mesenchymal stem cells can be achieved with purified rabbit bone marrow mononuclear cells through the immunomagnetic method, as the MesenCult® medium provides a suitable environment for a quick in vitro expansion, and the number of passages exerts negative influence on the morphological characteristics.

Evaluation of an immunomagnetic capture method followed by PCR to detect Mycobacterium bovis in tissue samples from cattle / Evaluación de un método de captura inmunomagnética seguida de PCR para la detección de Mycobacterium bovis en tejidos de ganado

Tuberculosis is one of the most important infectious diseases worldwide. Mycobacterium bovis is the causative agent of bovine tuberculosis (BTB), an important animal pathogen with public health implications as it is a zoonosis. Currently, the diagnosis of BTB is based on the caudal fold test of the Tuberculin Skin Test (TST). Post-mortem bacterial culture is carried out to confirm the diagnosis, and then specific biochemical tests are performed for the characterization of the etiologic agent. Culture takes at least 4 to 8 weeks to develop. The diagnosis by molecular tests such as PCR can provide fast and reliable results, significantly decreasing the time of confirmation (from two months to two days), thus allowing the possibility of taking control actions to prevent the spread of the disease in herds. In this work the use of an immunomagnetic separation capture followed by PCR (IMS-PCR) based on the IS6110 element showed a detection threshold corresponding to 10 CFU in M. bovis-spiked PBS. In the case of infected bovine fresh tissues, after five replicates, the minimum value of detection was 1000 CFU in 100% of the trials (5/5). This paper attempts to provide a sensitive, rapid and specific technique for the diagnosis of bovine tuberculosis, and opens up the possibility of a direct application in the control and eradication of this cattle disease.

La tuberculosis es una de las enfermedades infecciosas más importantes. Mycobacterium bovis es el agente causal de la tuberculosis bovina (TBB), un patógeno animal y zoonótico. En la actualidad, el diagnóstico de TBB se basa en la prueba intradérmica de la tuberculina. El cultivo bacteriano post mortem se lleva a cabo para confirmar el diagnóstico y a continuación se realizan pruebas bioquímicas específicas para la caracterización del agente etiológico. El cultivo bacteriano toma por lo menos 4 a 8 semanas para su desarrollo. El diagnóstico mediante pruebas moleculares como PCR puede proporcionar resultados rápidos y robustos, con un considerable acortamiento hasta la confirmación del diagnóstico (de 2 meses a 2 días). En este trabajo, el uso de captura inmunomagnética seguida de PCR (IMS-PCR) dirigida al elemento IS6110 mostró un umbral de detección correspondiente a 10 UFC en M. bovis diluido en PBS. En el caso de tejidos bovinos inoculados experimentalmente después de 5 réplicas, el valor mínimo de detección fue de 1000 UFC en el 100% de los ensayos. Este artículo aspira a proporcionar una técnica sensible, rápida y específica para el diagnóstico de la tuberculosis bovina, con el fin de abrir la posibilidad de una aplicación directa en el control y la erradicación de esta enfermedad en el ganado.