Metabolitos de bacterias lácticas antagónicos al crecimiento de microorganismos cariogénicos / Antagonistic activity of lactic acid bacteria metabolites toward cariogenic microorganisms growth

Aislar, purificar y conservar cepas de Streptococcus spp. y lactobacillus spp. de la cavidad bucal y enfrentarlas "in vitro" a bacterias lácticas. Materiales y métodos: se seleccionaron individuos con caries y se recolectaron muestras de saliva. Para recuperar Streptococcus spp. se empleó el medio Mitis Salivarius (Difco, Detroit, MI, Estados Unidos) y para Lactobacillus spp. se usó Rogosa (Blokar Diagnostics, Beauvais, Francia). Como cepas productoras de bacteriocinas se utilizaron 7 cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis, 2 de Leuconostoc mesenteroides y 1 de Lactococcus lactis subsp. diacetylactis. La actividad antagónica de las bacterias lácticas al crecimiento in vitro de bacterias cariogénicas se determinó con el método de difusión en agar. Resultado: el desarrollo y la multiplicación de las cepas de Streptococcus spp. de origen bucal ensayadas se vieron afectados por la presencia de metabolitos generados por las cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis. Conclusión: el crecimiento de las cepas de Streptococcus subsp. fue inhibido por efecto de L. lactis subsp. lactis...

Bacteriocinogenic Lactococcus lactis subsp. lactis DF04Mi isolated from goat milk: characterization of the bacteriocin

Lactic acid bacteria capable of producing bacteriocins and presenting probiotic potential open innovative technological applications in the dairy industry. In this study, a bacteriocinogenic strain (Lactococcus lactis subsp. lactis DF4Mi) was isolated from goat milk, and studied for its antimicrobial activity. The bacteriocin presented a broad spectrum of activity, was sensitive to proteolytic enzymes, resistant to heat and pH extremes, and not affected by the presence of SDS, Tween 20, Tween 80, EDTA or NaCl. Bacteriocin production was dependent on the components of the culture media, especially nitrogen source and salts. When tested by PCR, the bacteriocin gene presented 100% homology to nisin Z gene. These properties indicate that this L. lactis subsp. lactis DF4Mi can be used for enhancement of dairy foods safety and quality.

Antimicrobial activity of the Nisin Z producer Lactococcus lactis subsp. lactis Lc08 against Listeria monocytogenes in skim milk / Atividade antimicrobiana de Lactococcus lactis subsp. lactics Lc08 produtor de Nisina Z contra Listeria monocytogenes em leite desnatado

The presented study aimed to verify the effect of different pH values, enzyme solutions and heat treatments on the antimicrobial activity of the bacteriocinogenic strain Lactococcus lactis subsp. lactis Lc08 and to test their antimicrobial activity against Listeria monocytogenes in reconstituted skim milk at refrigeration temperatures. This strain was previously described as a nisin Z producer and capable of inhibiting L. monocytogenes growth in in vitro tests. The antimicrobial activity of the bacteriocin cell-free supernatant of Lc08 was sensitive to enzyme treatments (except papain). The pH values and heating (65ºC for 30min, 75ºC for 15s) had no apparent effect on the antimicrobial activity of the bacteriocin produced by Lc08. Only treatment at autoclave conditions result in loss of their antimicrobial activity. Lc08 presented antimicrobial activity against L. monocytogenes in the milk system after 12h at 25ºC. No effect was found at 7ºC. The results show the application viability of the Lc08 in food systems as a biopreservative against L. monocytogenes.

O presente estudo teve como objetivo verificar o efeito de diferentes valores de pH, soluções enzimáticas e tratamentos térmicos na atividade antimicrobiana da cepa bacteriocinogênica Lactococcus lactis subsp. lactis Lc08 e testar sua atividade antagonista contra Listeria monocytogenes em leite desnatado reconstituído em diferentes temperaturas de estocagem. Essa cepa já foi descrita como produtora de nisina Z e capaz de inibir o desenvolvimento de L. monocytogenes em testes in vitro. A atividade antimicrobiana do sobrenadante de Lc08 contendo a bacteriocina produzida e livre de células foi sensível ao tratamento pelas enzimas testadas (exceto papaína). A aplicação de diferentes valores de pH e o tratamento térmico (65ºC por 30 min, 75ºC por 15s) não influenciaram na atividade antimicrobiana da bacteriocina produzida por Lc08. Apenas o tratamento em autoclave resultou em perda da sua capacidade em inibir o desenvolvimento de L. monocytogenes. A cepa Lc08 apresentou atividade antagonista contra L. monocytogenes em leite após período de estocagem de 12h a 25ºC. Não foi observado efeito a 7ºC. Os resultados mostram a viabilidade de aplicação da cultura Lc08 ou de sua bacteriocina em produtos lácteos como bioconservador contra L. monocytogenes.

Caracterização da bacteriocina produzida por Lactococcus lactis subsp. lactis MK02R isolado de rúcula (Euruca sativa Mill.) e avaliação do seu potencial probiótico utilizando o modelo dinâmico TIM-1 / Characterization of the bacteriocin produced by Lactococcus lactis subsp. lactis isolated MK02R rocket salad (Euruca sativa Mill.) and evaluation of its potential probiotic using the dynamic model TIM-1

Após a constatação da escassez de estudos realizados com vegetais crus na busca por novas estirpes de bactérias láticas (BAL) produtoras de bacteriocinas e diante do potencial tecnológico da aplicação destas cepas tanto como agentes de conservação em alimento, bem como cultura probiótica em alimentos funcionais, este estudo objetivou isolar e identificar cepas de bactérias láticas potencialmente bacteriocinogênicas de amostras de rúcula obtidas no comércio local de São Paulo, SP - Brasil, identificar e caracterizar as bacteriocinas produzidas pelos isolados e avaliar o potencial probiótico dos isolados testando sua sobrevivência no modelo dinâmico do trato gastrointestinal TNO gastro-Intestinal Model - TIM-1 disponível no TNO (The Netherlands Organization for Applied Scientific Research) divisão Quality of Life (Zeist, Holanda). A produção de bacteriocinas neste modelo também foi avaliada, comparando-se com L. sakei 2a, também produtora de bacteriocinas e ainda avaliou-se a interferência na viabilidade de E. faecium LMA1. A cepa Lactococcus lactis subsp. lactis MK02R de rúcula produziu uma bacteriocina sensível à enzimas proteolíticas, termoestável e não influenciada pelo pH, sendo capaz de inibir Enterococcus faecium, Lactobacillus sakei, Listeria innocua, Lactobacillus delbrueckii e Listeria Monocytogenes de diferentes grupos sorológicos. Os ensaios genéticos utilizando primers Nisf e Nisr confirmaram que a bacteriocina MK02R é uma nisina, apresentando uma alteração dos aminoácidos no peptídeo líder em relação às nisinas A, Z, Q, F e U, porém com a estrutura do peptídeo maduro idêntica ao da nisina F. Estes resultados foram confirmados por espectrometria de massas de amostras purificadas por HPLC. L. lactis MK02R resistiu à passagem no modelo dinâmico TIM-1, apresentando uma alta capacidade de sobreviver nas condições simuladas do trato gastrointestinal humano. Entretanto, não foi capaz de causar a redução no número de E. faecium LMA1. Em contrapartida, L. sakei 2a, mesmo apresentando uma sobrevivência menor, foi capaz de causar uma redução de 70% na população de E. faecium LMA1 no ambiente simulado do TGI. Não foi detectada atividade residual da ação antimicrobiana das bacteriocinas produzidas por L. lactis MK02R ou L. sakei 2a após a passagem pelo modelo dinâmico TIM-1. Estes resultados evidenciam a possível aplicação de L. lactis MK02R como um agente de controle biológico na conservação de alimentos e também como uma cultura potencialmente probiótica

Given the scarcity of studies performed with raw vegetables addressing the search for new bacteriocinogenic strains of lactic acid bacteria (LAB) and considering the technological application of these strains as food preservatives and probiotic cultures in functional foods, this study was aimed at isolation and identification of bacteriocinogenic LAB strains from samples of rocket salad obtained in the local market of São Paulo, SP - Brazil, subsequent characterization of the bacteriocins produced by these LABs and evaluation of their probiotic potential by testing their survival in the dynamic gastrointestinal model TNO gastro- Intestinal-Model - TIM-1, available at the TNO (Netherlands Organization for Applied Scientific Research) Quality of Life division (Zeist, Netherlands). The studies in the TIM-1 model were also done with another bacteriocinogenic strain L. sakei 2a for comparison, evaluating their interference on the viability of E. faecium LMA1. The bacteriocin produced by strain Lactococcus lactis subsp. lactis MK02R isolated from rocket salad was sensitive to proteolytic enzymes, heat-stable and not influenced by the pH. The bacteriocin inhibited the growth of Enterococcus faecium, Lactobacillus sakei, Listeria innocua, Lactobacillus delbrueckii the primers Nisf and Nisr indicated that the bacteriocin produced by the strain MK02R is a nisin, with a change in the amino acid sequence of the leader peptide when compared to nisin A, Z, Q, U and F, but with the structure of the mature peptide homologous to that of nisin F. These results were confirmed by mass spectrometry of purified samples obtained by HPLC. L. lactis MK02R withstood the test in the dynamic model TIM-1, presenting capability to survive in the simulated conditions of the human gastrointestinal tract. However, the strain was not able to cause a reduction in the number of E. faecium LMA1. On the other hand, L. sakei 2a, even presenting lower survival, was able to cause 70% reduction in the population of E. faecium LMA1 in the gut simulated environment. No residual antimicrobial activity of bacteriocin produced by L. lactis MK02R or L. sakei 2a was detected after the transit through the dynamic model TIM-1. These results demonstrate the possible application of L. lactis MK02R both as a biocontrol agent in food preservation and as a potentially probiotic culture

Produção e purificação de nisina produzida por Lactococcus lactis em leite desnatado e soro de leite / Nisin production and purification utilizing Lactococcus lactis is skimmed milk and milk whey

O peptideo antimicrobiano retratado neste trabalho é a nisina, produzido pela bacteria Lactococcus lactis subsp. lactis, urn peptideo estruturalmente composto por 34 aminoácidos, mostra urn vasto espectro de atividade inibitória em microrganismos Gram-positivos, Gram-negatios e esporo formadores. O objetivo deste trabalho foi produzir a nisina a partir de células de Lactococcus lactis utilizando soro de leite e leite desnatado como meio de cultivo. Para tanto as células de L. lactis foram desenvolvidas em agitador rotacional (30°C/36 h/100 rpm) e a atividade de nisina, os parâmetros de crescimento e os componentes do meio de cultivo foram analisados. Em leite desnatado, contendo 2,27 g de sólidos totais, a atividade de nisina foi 20077,05 AU.mLˉ¹ sendo 3 vezes maior em relação ao leite desnatado corn 4,54 g sólidos totais, 8739,77 AU.nnLˉ¹ ; e foi 73 vezes major em relacão ao leite desnatado corn 1,14 g sólidos totais, 273,21 AU.mLˉ¹ . 0 soro de leite utilizado foi doado por uma inc:Istria de lacticínios, em laboratório parte do soro foi tratada de duas formas: (i) filtrado e (ii) esterilizado, e ambos foram utilizados para cultivo das células produtoras de nisina em agitador rotacional 30°C/36 h/100 rpm. Os resultados mostraram que o meio de cultivo composto por soro de leite não filtrado forneceu uma adaptação ao L. lactis, sendo a concentração de nisina obtida 1628 vezes maior que do soro de leite filtrado, 11120,13 e 6,83 mg.Lˉ¹ respectivamente. Em relação atividade de nisina contra Gram-negativos, aumentou-se o efeito bactericida quando adicionada ao EDTA. O comportamento da nisina no sistema micelar de duas fases aquosas foi investigado experimentalmente, demonstrando que a biomolécula alvo pode ser extraída tanto do meio fermentado complexo quanto das impurezas presentes na nisina comercial. Nos testes corn o sistema micelar de duas fases aquosas, a nisina particionou, preferencialmente, para a fase rica em micelas...

Nisin is a natural antimicrobial peptide used as food preservative produced by Lactococcus lactis, that inhibits the outgrowth of spores, the growth of a variety of Gram-positive and Gram-negative bacteria. Applications of this bacteriocin include dental care products pharmaceutical products such as stomach ulcers and colon infection treatment and potencial birth control. This study aims to evaluate growth conditions for L. lactis as well as the effect in nisin production when utilizing milk whey and skimmed milk. Lactococcus lactis ATCC 11454 was developed in a rotatory shaker (30°C/36 h/100 rpm) in diluted skimmed milk and nisin expression, growth parameters and media components were also studied. Nisin expression in skimmed milk 2.27 g total solids (20077.05 AU.mLˉ¹ ) was up to 3-fold higher than transfers in skimmed milk 4.54 g total solids (8739.77 AU.mLˉ¹ ) and was up to 85-fold higher than transfers in skimmed milk 1.14 g total solids (273.21 AU.mLˉ¹ ). Milk whey, a byproduct from dairy industries, was utilized in two different ways (i) without filtration, autoclaved at 121°C for 30 min and (ii) filtrated (1.20 pm and 0.22 vim membrane filter), L. lactis was developed in a rotary shaker (30°C/36 h/100 rpm) and these cultures were transferred five times using 5 mL aliquots of broth culture for each new volume of the respective media. The results showed that culture media composed by milk whey without filtration was better for L. lactis in its adaptation than milk whey without filtration. Nisin titers, in milk whey without filtration, was 11120.13 mg.Lˉ¹ in 2nd transfer, and up to 1628-fold higher than the filtrated milk whey, 6.83 mg.Lˉ¹ in 1 St transfer. Nisin activity was assayed by the agar diffusion method using Lactobacillus sakei ATCC 15521 and a recombinant Escherichia coli DH5a expressing the recombinant green fluorescent protein (GFPuv) as the nisin-susceptible test organisms. Combining EDTA with nisin increased the bactericidal effect of...

Predicción del crecimiento de la Lactococcus lactis subsp. lactis en leche descramada estéril en función a la temperatura / Growth prediction of Lactococcus lactis subsp. lactis in sterile skimed milk as a function of temperature

Diversos modelos matemáticos han sido desarrollados con el objeto de predecir el comportamiento de las poblaciones bacterianas en fase de crecimiento en condiciones controladas a nivel de laboratorio, muchos de estos han sido validados en condiciones de producción, transporte y almacenamiento de alimentos. El objetivo del presente trabajo fué adaptar un modelo matemático utilizando ecuaciones obtenidas como resultado del análisis con modelos secundarios de los coeficientes de regresión de la ecuación de Gompertz, a efectos de lograr predecir las poblaciones en crecimiento de Lactococcus lactis subsp. lactis en leche en polvo reconstituida y esterilizada, controlando la temperatura en el rango desde 9 a 39°C. Con este fin, los coeficientes “A” y “B” se analizaron con el modelo de la raíz cuadrada, obteniéndose valores de R2 = 0,819 y 0,991, respectivamente, mientras que el modelo hiperbólico se utilizó para modelar los coeficientes “D” (R2= 0,812) y “M” (R2= 0,995). Finalmente se obtuvo una expresión reparametrizada del modelo original de Gompertz, sustituyendo cada coeficiente de regresión por la ecuación que lo describe, en función a las diferentes temperaturas estudiadas, siendo este modelo utilizado para predecir directamente las poblaciones del microorganismo en estudio a cualquier temperatura dentro del rango estudiado. Se obtuvieron diferencias muy pequeñas entre la población observada experimentalmente y la ajustada según la aplicación del modelo desarrollado, observándose una distribución bastante equilibrada de los valores residuales. Se recomienda utilizar este tipo de modelo para describir el crecimiento de poblaciones combinadas en productos como leche pasteurizada comercial.

Several mathematic models have been developed to predict the behavior of bacteria populations in growing phase and controlled conditions at the laboratory. Many of these models have been validated under food production, transportation and storage conditions. The objective of this study was to adapt a mathematical model using equations obtained as a result of the analysis with secondary models of regression coefficients from the Gompertz equation, to predict population of Lactococcus lactis subsp. lactis in the growing phase in reconstituted and sterilized powder milk, controlling temperature in a range of 9 to 39°C. Prediction was done by the analysis of “A” and “B” coefficients, using the square root model, obtaining R2 values = 0.819 and 0.991, respectively. Furthermore, a hyperbolic model was used for modeling “D” (R2= 0.812) and “M” (R2= 0.995) coefficients. Finally, a reparametrized expression of the original Gompertz model was obtained replacing each regression coefficient by the described equation, in relation to the different studied temperatures. Thus, this model was used to directly predict the population of microorganism under study at any temperature in the studied range. Small differences were obtained between both, the experimental and the adjusted populations, according to the application of the developed model. A well balanced distribution of the residual values was observed. The use of this type of models is recommended to describe growth of combined microorganism populations in products such as commercial pasteurized milk.

Obtenção de bactéria ácido lática, como cultivo iniciador, a apartir da caracterização de bactérias ácido láticas isoladas de salames artesanais / Attainment of lactic acid bacteria, as culture initiating, characterization of isolated lact acid bacteria of artisan sausage

Bactéria ácido lática homofermentativa foi isolada de salame artesanal, caracterizada como Lactococcus lactis ssp lactis e submetida ao processo de fermentação, a fim de obter a concentração desejada (8,76 log10 UFC/g) para sua utilização como cultivo iniciador.

Modelos cinéticos aplicados al crecimiento de Lactococcus lactis subsp lactis en leche / Growth kinetics models applied to Lactococcus lactis subsp lactis in milk

El Lactococcus lactis subsp, lactis es una bacteria ácido-láctica muy utilizada como cultivo iniciador principalmente en quesos madurados, capaz de producir algunas bacteriocinas, entre estas la nisina, por lo cual su uso como preservador en importante. En el presente trabajo se utilizaron modelos cinéticos con el objeto de describir el crecimiento de este microorganismo en leche en polvo reconstituida, con los cuales es posible predecir su dinámica dentro del rango de temperatura estudiado, entre 9 y 39°C. Se utilizó la ecuación de Gompertz con cuatro parámetros de regresión para modelar cada una de las curvas de crecimiento obtenidas experimentalmente. Como resultado de este proceso, se obtuvieron los parámetros necesarios para calcular la fase de adaptación, tasa de crecimiento exponencial (µm) y el tiempo de generación (Tg). Estos parámetros microbiológicos fueron relacionados con la temperatura en un modelo secundario, en el cual, la fase de adaptación y el tiempo de generación fueron bien ajustados utilizando una ecuación hiperbólica, obteniendo un R²= 0,922 y 0,991 respectivamente, mientras que la tasa de crecimiento se modeló utilizando la ecuación de la raíz cuadrada de Ratkowsky (R²= 0,991). Se recomienda utilizar la metodología descrita para estudiar el crecimiento de este microorganismo en quesos frescos, incluyendo en el modelo la cinética de producción de nisina.

Reduction of non-digestible oligosaccharides in soymilk: application of engineered lactic acid bacteria that produce alpha-galactosidase

Human consumption of soy-derived products has been limited by the presence of non-digestible oligosaccharides (NDO), such as the alpha-galactooligosaccharides raffinose and stachyose. Most mammals, including man, lack pancreatic alpha-galactosidase (alpha-Gal), which is necessary for the hydrolysis of these sugars. However, such NDO can be fermented by gas-producing microorganisms present in the cecum and large intestine, which in turn can induce flatulence and other gastrointestinal disorders in sensitive individuals.The use of microorganisms expressing alpha-Gal is a promising solution to the elimination of NDO before they reach the large intestine. In the present study, lactic acid bacteria engineered to degrade NDO have been constructed and are being used as a tool to evaluate this solution. The alpha-Gal structural genes from Lactobacillus plantarum ATCC8014 (previously characterized in our laboratory) and from guar have been cloned and expressed in Lactococcus lactis. The gene products were directed to different bacterial compartments to optimize their possible applications. The alpha-Gal-producing strains are being evaluated for their efficiency in degrading raffinose and stachyose: i) in soymilk fermentation when used as starters and ii) in situ in the upper gastrointestinal tract when administered to animals orally, as probiotic preparations. The expected outcomes and possible complications of this project are discussed.