Quimiotipos, Extracción, Composición y Aplicaciones del Aceite Esencial de Lippia alba / Quimiotipos, extração, composição e uso do óleo essencial de Lippia alba / Chemotypes, extraction, chemical composition and use of lippia alba essential oil

RESUMO Lippia alba é uma planta amplamente distribuída nas zonas tropicais, subtropicais e temperadas das Américas, África e Ásia. O óleo essencial de L. alba tem sido amplamente estudado, entretanto apresenta variações de produção. Portanto este estudo teve como objetivo realizar uma revisão dos principais quimiotipos, métodos de extração, composição e aplicação do óleo essencial de L. alba. Neste estudo são discutidos os principais quimiotipos e sua relação com fatores genéticos e características morfológicas. Também são discutidos os fatores que afetam o rendimento de produção, composição química, métodos de extração e do uso e da atividade biológica do óleo essencial de L. alba. Apesar da vasta literatura sobre os óleos essenciais de L. alba, ainda desenvolvimento de aplicações para a produção de cosméticos, fármacos e alimentos, bem como faltam definições agronomicas sobre o cultivo e melhoramento desta planta.

ABSTRACT Lippia alba is a plant widely distributed in tropical, subtropical and temperate zones of the Americas, Africa and Asia. The essential oil of L. alba has been widely studied and there are many variations in the production process. Therefore, this study is aimed at conducting a review of the main chemotypes, extraction methods, composition and application of the essential oil of L. alba. In this study, the main chemotypes and its relation to genetic and morphological characteristics are discussed. It also discusses the factors that affect the yield, chemical composition, extraction methods and the use and the biological activity of the essential oil of L. alba. Despite the vast literature on the essential oils of L. alba, there is still a lack of development in its application for the production of cosmetics, pharmaceuticals and food, as well as a lack of agronomic definitions for its cultivation and genetic improvement.

Potencial do óleo essencial de erva-luísa (Aloysia citriodora Palau) no controle de Fusarium sp. in vitro / Essential oil potential herb-luisa (Aloysia citriodora Palau) in the control of Fusarium sp. in vitro

RESUMO O presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o potencial do uso do óleo essencial de Aloysia citriodora no controle in vitro de Fusarium sp., isolado de plântulas de beterraba infectadas com o mesmo. O trabalho foi realizado por meio de dois experimentos: um sobre o efeito do óleo essencial no crescimento micelial, e outro sobre o efeito na germinação de conídios do fungo. No primeiro trabalho, avaliou-se em delineamento inteiramente ao acaso, o efeito das concentrações 0,0155%; 0,0315%; 0,0625%; 0,125%; 0,250% e 0,500% do óleo essencial de A. citriodora em placas de Petri® com meio de cultivo BDA, mais a testemunha, com meio BDA puro. Cada placa foi considerada uma repetição, as quais foram incubadas a 24ºC±1ºC e submetidas a fotoperíodo de doze horas. Avaliou-se o crescimento radial do patógeno em função do crescimento micelial do patógeno quando este atingia as bordas da primeira placa. No segundo experimento, as mesmas concentrações foram testadas, nas mesmas condições de incubação, no entanto, em lâminas de microscopia com meio BD. Utilizou-se delineamento inteiramente ao acaso, sendo considerada como unidade experimental cada lâmina utilizada. Avaliou-se 24 horas após a incubação, em microscópio óptico, a germinação dos primeiros vinte conídios visualizados a partir do canto esquerdo superior para o direito. Os resultados do segundo experimento foram expressos em porcentagem de germinação de conídios. Os resultados obtidos permitiram concluir que este óleo essencial possui efeito fungistático e fungicida sobre o crescimento micelial e na germinação de conídios de Fusarium sp.. Além disso este efeito é maior em função do aumento da concentração do óleo essencial.

ABSTRACT This study aimed to evaluate the potential use of Aloysia citriodora essential oilisolated from beet seedlings infected with it. The study was performed by conducting two experiments evaluating the effect of the essential oil on mycelial growth and fungus conidia germination. In the first study, in a completely randomized design, the effect concentrations (0.0155%; 0.0315%; 0.0625%; 0.125%; 0.250% and 0.500%) of essential oil of A. citriodorawas evaluated on Petri® dish with a PDA cultivation medium, plus the control, with half pure PDA. Each plate was taken as a repeat, and incubated at 24°C±1°C and a photoperiod of twelve hours. The radial growth of the pathogen, when the first plate was hit by the mycelial growth of the pathogen on its edges was evaluated. In the second experiment, the same concentrations were tested under the same incubationconditions, however, on microscope slides with half PD medium. The design was used completely randomized, each microscope slide used was considered as one experimental unit. Germination of the first 2 conidia strains, viewed from the upper left to the right was evaluated24 hours after incubation, using an optical microscope. The results of the second experiment were expressed as a percentage of conidia germination. The results obtained showed that this essential oil has fungistatic and fungicidal effect on the mycelial growth and at the conidia germination of Fusarium sp., which has a greater effect with increasing concentrations.

Análise fitoquímica e atividade antifúngica do óleo essencial de folhas de Lippia sidoides Cham. e do Timol contra cepas de Candida spp / Phytochemical analysis and antifungal activity of the essential oil of Lippia sidoides Cham. and of the Thymol against Candida strains

RESUMO A resistência de fungos do gênero Candida aos fármacos químicos tem lançado o desafio de se identificar novas substâncias que possuam atividade antibiótica ou venham a modular o efeito de produtos atualmente usados contra candidíase. O presente estudo avaliou a atividade antifúngica do óleo essencial de Lippia sidoides Cham. e do timol, sobre cepas de Candida. Inicialmente os produtos foram testados frente a 16 cepas fúngicas pela técnica de difusão em meio sólido, o que permitiu selecionar linhagens para continuidade da pesquisa. Com as linhagens de Candida krusei (CK LMBM 01, CK LMBM 02), Candida albicans (CA LM 62) e Candida tropicalis (CT LM 20), procedeu-se, por microdiluição em caldo, a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e em meio sólido, a Concentração Fungicida Mínima (CFM) dos produtos foi identificada. O microcultivo das leveduras em meio empobrecido foi realizado para verificação de alterações morfológicas e, além disso, uma análise da composição química do óleo foi realizada por Cromatografia Gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). Nesta análise, o constituinte majoritário foi o timol (84,95%), seguido de compostos como p-cimeno e Éter metil carvacrol, entre outros. A CIM do óleo essencial de Lippia sidoides Cham. frente às cepas variou entre 64 e 256 μg/mL, enquanto a CIM do timol foi estabelecida entre 32 e 64 μg/mL. A CFM do óleo essencial foi determinada entre 128 e 512 μg/mL e para o timol foram encontrados valores entre 64 e 128 μg/mL. Em relação à análise micromorfológica, verificada nas concentrações de CIM e CIM x 2, o óleo essencial inibiu o dimorfismo das cepas CK 01 e CT 20 na CIM e quando foi ensaiado o timol, este, na CIM, impediu a transição morfológica das cepas CK 01 e CA 62. Uma redução da morfogênese também foi obsevada na cepa CT 20, porém apenas em CIM x 2 e de forma mais discreta. Os resultados enaltecem o potencial antifúngico de L. sidoides e de seu composto majoritário timol tanto no combate à Candida quanto na neutralização de um dos fatores de virulência, a capacidade invasiva por formação de hifas e pseudohifas verificado na condição patogênica da candidíase. Estes dados são promissores e poderão incentivar futuras pesquisas sobre os aspectos fitoquímicos, toxicológicos e farmacológicos tanto do óleo essencial de Lippia sidoides como também de seus componentes químicos.

ABSTRACT The resistance of the Candida against drugs has been a challenge to the discovery of new substances with antimicrobial or modulatory effects that could be used against the cadidiasis. This work evaluated the antifungal activity of the essential oil of Lippia sidoides Cham. and of the Thymol against Candida strains. The products were tested towards 16 strains of Candida using the diffusion method, which allowed to select the strains in order to proceed with the research. The strains of Candida krusei (CK LMBM 01, CK LMBM 02), Candida albicans (CA LM 62) and Candida tropicalis (CT LM 20) were assayed by the microdilution method so that the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and the Minimal Fungicide Concentration (MFC) could be determined. The morphogenesis of the Candida was evaluated using poor environment in order to observe morphological changes. The composition of the essential oil was determined by GC-MS. The main compound observed was the thymol (84.95%). The MIC of the essential oil of L. sidoides and Thymol ranged between 64 to 256 μg/mL, and between 32 to 64 μg/mL respectively. The MFC of the essential oil and the thymol varied between 128 to 512 μg/mL and 64 to 128 μg/mL respectively. The morphogenesis of different Candida strains was inhibited in the MIC and MICx2 to the essential oil and thymol. The results indicated the antifungal potential of the L. sidoides and of the Thymol due to the inhibition of the invasive capacity, one of the most important virulence factors for the candidiasis` development. These results are promising to new researches about the phytochemical, toxicological and pharmacological aspects of the essential oil of L. sidoides and its phytochemical compounds.

Atividade fungitóxica in vitro dos óleos essenciais de Lippia sidoides Cham., Cymbopogon citratus(D. C. ) Stapf. e de seus constituintes majoritários no controle de Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii / Fungitoxicity in vitro of essential oils from Lippia sidoides Cham., Cymbopogon citratus (D. C. ) Stapf. and their major constituents in the control of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii

RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial fungitóxicos dos óleos essenciais de Cymbopogon citratus, Lippia sidoides, e de seus constituintes majoritários, sobre o crescimento micelial dos fitopatógenos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. A caracterização química do óleo de L. sidoides demonstrou a presença do carvacrol (33,27%) e o 1,8-cineol (24,41%) como seus componentes majoritários. Enquanto que o citral (77,6%) foi o constituinte majoritário do óleo essencial de C. citratus. A avaliação do potencial fungitóxico dos óleos essenciais e de seus constituintes majoritários foi realizada por meio de ensaios in vitro, avaliando a inibição do crescimento micelial dos microrganismos. Ambos os óleos essenciais inibiram totalmente o crescimento micelial de R. solani na concentração de 400 µg mL-1. O crescimento micelial de S. rolfsii foi inibido pelo óleo essencial de C. citratus na concentração de 300 µg mL-1 e pelo óleo essencial de L. sidoides na concentração de 400 µg mL-1. Em relação aos constituintes majoritários, o 1,8-cineol não apresentou efeito fungitóxico nas concentrações avaliadas. No entanto, o carvacrol e o citral foram mais efetivos que os óleos essenciais havendo ausência de crescimento micelial de R. solani e de S. rolfsii nas concentrações de 200 µg mL-1 e 225 µg mL-1, respectivamente.

ABSTRACT The objective of this study was to evaluate the fungitoxic potentials of the essential oils of Cymbopogon citratus, Lippia sidoides, and of its major constituents, on the mycelial growth of phytopathogens Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii. The chemical characterization of L. sidoides oil showed the presence of carvacrol (33.27%) and of 1,8-cineole (24.41%) as its major components, whereas citral (77.6%) was the major constituent of C. citratus essential oil. The evaluation of the fungitoxic potential of the essential oils and of its major constituents was performed through in vitro assays, the microorganisms mycelial growth inhibition. Both essential oils totally inhibited the mycelial growth of R. solani at 400 µg mL-1. Regarding the major constituents, the 1,8-cineole did not show fungitoxic effect at the concentrations evaluated. However, the carvacrol and the citral were more effective than the essential oils and there was no mycelial growth of R. solani and of S. rolfsii at the concentrations of 200 µg mL-1 and 225 µg mL-1, respectively.

Avaliação da atividade antibacteriana do óleo essencial de Lippia origanoides frente à Staphylococcus sp. isolados de alimentos de origem animal / Assessment of the antibacterial activity of the essential oil of Lippia origanoides in relation to Staphylococcus sp. isolated from food of animal origin

Objetivou-se no trabalho avaliar a ação antibacteriana do óleo essencial de Lippia origanoides frente à isolados de Staphylococcus sp. de alimentos de origem animal. Para tanto, realizou-se análise química da composição do óleo, teste de sensibilidade das bactérias frente a dez antibióticos de uso terapêutico e ao óleo essencial de Lippia origanoides, além da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e da concentração bactericida mínima (CBM). A análise cromatográfica do óleo apresentou o timol como composto majoritário (48,70%), além de pequena quantidade de carvacrol (1,14%). No teste de sensibilidade frente aos antibióticos, 75% dos isolados apresentaram resistência a, no mínimo, três antibióticos. Em relação ao óleo essencial, os isolados de Staphylococcus sp oriundos de leite bovino mostraram-se mais resistentes e os isolados de carne ovina apresentaram-se mais sensíveis. A CIM foi maior para os Staphylococcus sp. isolados de leite bovino e leite ovino (60µL/mL). Enquanto que para os isolados de carcaça de ovinos e queijo, a CIM foi de 15µL/mL e 30µL/mL respectivamente. A CBM, consequentemente, foi maior para os isolados de leite bovino e leite ovino, sendo de 240µL/mL e 120µL/mL respectivamente. O óleo essencial de Lippia origanoides apresenta atividade antimicrobiana sobre Staphylococcus sp. isolados de alimentos.

The aim of this study was to evaluate the antibacterial activity of the essential oil of Lippia origanoides in relation to Staphylococcus sp. isolated from food of animal origin. For this purpose, we performed the chemical analysis to determine the oil composition, evaluated the bacteria sensibility to ten antibiotics of therapeutic use and determined the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC). The chromatographic analysis showed that tymol was the main compound (48.70%) and that carvacrol was present in a small amount (1.14%). In the test of antibiotic susceptibility, 75% of the microorganism isolates were resistant to at least three of the ten antibiotics tested. The Staphylococcus sp isolated from bovine milk was more resistant to the essential oil of Lippia origanoides, and the microorganism isolated from sheep meat was more susceptible to this oil. The Staphylococcus sp. isolated from bovine or sheep milk showed a MIC of 60µL/mL and for those isolated from sheep carcass and cheese the MIC was 15µL/mL and 30µL/mL, respectively. Consequently, the MBC was higher for isolates from cow's (240µL/mL) and sheep's milk (120µL/mL) when compared with other food sources. These results suggest that the essential oil of Lippia origanoides has antimicrobial activity against staphylococcus sp. isolated from food.

Karyotype analysis, DNA content and molecular screening in Lippia alba (Verbenaceae)

Cytogenetic analyses, of pollen viability, nuclear DNA content and RAPD markers were employed to study three chemotypes of Lippia alba (Mill.) (Verbenaceae) in order to understand the genetic variation among them. Different ploidy levels and mixoploid individuals were observed. This work comprises the first report of different chromosome numbers (cytotypes) in L. alba. The chromosome numbers of La2-carvone and La3-linalool chemotypes suggested that they are polyploids. Flow cytometric analysis showed an increase of nuclear DNA content that was not directly proportional to ploidy level variation. A cluster analysis based on RAPD markers revealed that La3-linalool shares genetic markers with La1-citral and La2-carvone. The analysis showed that the majority of genetic variation of La3-linalool could be a consequence of ixoploidy. ur data indicates that sexual reproduction aong those three chemotypes is unlikely and suggests the beginning of reproductive isolation. The results demonstrated that chromosome analysis, nuclear DNA content estimation and RAPD markers constitute excellent tools for detecting genetic variation among L. alba chemotypes.

Análises citogenéticas, de viabilidade do pólen, do conteúdo de DNA nuclear e marcadores RAPD foram empregadas no estudo de três quimiotipos de Lippia alba (Mill.) (Verbenaceae) visando contribuir para o entendimento da variação genética entre os mesmos. Diferentes níveis de ploidia e indivíduos mixoploides foram observados. Este trabalho compreende o primeiro relato de diferentes números cromossômicos (citótipos) em L. alba. Os números cromossômicos dos quimiotipos La2-carvona e La3-linalol sugere que eles seja poliploides. A análise da citometria de fluxo mostrou um aumento do conteúdo de DNA nuclear que não foi diretamente proporcional à variação no nível de ploidia. A análise de agrupamento baseada nos marcadores RAPD demonstrou que La3-linalol compartilha marcadores genéticos com La1-citral e La2-carvona. A análise mostrou que a maior parte da variação genética de La3-linalol pode ser consequência da mixoploidia. Nossos dados indicam que a reprodução sexual entre os três quimiotipos parece improvável, sugerindo o início de isolamento reprodutivo. Os resultados demonstraram que a análise cromossômica, a quantificação do DNA nuclear estimado e os marcadores RAPD constituem excelentes ferramentas para detecção de variação genética entre quimiotipos de L. alba.