Resistência aos antimicrobianos e diversidade genética de variantes fenotípicas de Pseudomonas aeruginosa não sensíveis aos carbapenêmicos recuperadas de pacientes com fibrose cística com infecção pulmonar crônica: uma análise temporal / Antimicrobial resistance and genetic diversity of phenotypic variants of carbapenem non susceptible Pseudomonas aeruginosa recovered from patients with cystic fibrosis with chronic lung infection: a temporal analysis

Pseudomonas aeruginosa, bactéria ubíqua e versátil, pode se comportar como um patógeno oportunista, com ampla capacidade adaptativa, por múltiplos fatores de virulência e resistência. Como agente patogênico nas infecções pulmonares em pacientes com fibrose cística (FC), é motivo de prognóstico ruim, aumento de hospitalizações e altas taxas de morbimortalidade, sendo quase impossível a sua erradicação, ao evoluírem para a cronicidade. Globalmente, é notável o aumento nos índices de amostras não sensíveis aos carbapenêmicos e a múltiplos antimicrobianos, essenciais à terapêutica. Assim, avaliamos temporalmente a susceptibilidade aos antimicrobianos e a presença de amostras hipermutáveis (HPM) em P. aeruginosa de diferentes morfotipos, não sensíveis aos carbapenêmicos (PANSC), obtidas de pacientes FC com infecção pulmonar crônica, acompanhados em dois centros de referência no Rio de Janeiro. De 2007 a 2016, a análise retrospectiva, através dos resultados obtidos no teste de disco-difusão (TDD), permitiu selecionar amostras de PANSC incluídas neste trabalho. Usando os resultados obtidos no TDD, foi definida a susceptibilidade a outros antimicrobianos, bem como os fenótipos de resistência, multi-(MDR), extensivo-(XDR) e pandroga resistentes (PDR). Adicionalmente, determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM) para imipenem (IPM), meropenem (MEM), doripenem (DOR) e polimixina (POL). Através de teste fenotípico, foi calculada a frequência de mutação espontânea e as amostras hipermutáveis foram caracterizadas. O sequenciamento de genoma total (SGT) foi realizado em seis amostras de diferentes morfotipos, incluindo uma variante fenotípica rara, a small colony variant (SCV). Essas amostras foram recuperadas em dois episódios de exacerbação do paciente. Foram investigadas a clonalidade, resistência a antimicrobianos e virulência. Das 143 amostras, de 18 pacientes (9 pediátricos e 9 adultos), os resultados do TDD apontaram taxas de não susceptibilidade superiores a 44% para gentamicina, amicacina, tobramicina e ciprofloxacina, e maiores de 30 % para POL. Pela determinação da CIM, quase a totalidade (96%) das amostras foram não sensíveis a IMP, seguidos de 56% para MEM e 44% para DOR. Analisando-se a distribuição dos valores da CIM50 e CIM90 nos dois grupos de pacientes, os valores para IMP foram maiores entre as amostras dos pacientes pediátricos, equivalendo a 32 µg/mL e 64 µg/mL, respectivamente. Cerca de 25%, 37% e 6% eram MDR, XDR e PDR, respectivamente. Aproximadamente 12% eram HPM, e mais da metade destas foram XDR. Após o SGT, as seis amostras, recuperadas do caso clínico foram classificadas em um novo sequence type (ST2744), com a presença de genes de resistência adquiridos blaPAO, blaOXA-50, aph(3')-Iib, fosA, catB7 e crpP, apresentando mutações em genes codificadores de porinas e bombas de efluxo. Entretanto, não foram observados marcadores genéticos clássicos exclusivos para os fenótipos SCV e HPM. Este é o primeiro relato de P. aeruginosa SCV na FC, no Brasil. A vigilância epidemiológica de P. aeruginosa é crucial para a conduta terapêutica, bem como para o sucesso da resposta do paciente e erradicação da infecção pulmonar, justificando o uso de técnicas fenotípicas e moleculares na detecção dos mecanismos de resistência e virulência desse microrganismo na FC.

Pseudomonas aeruginosa, a ubiquitous and versatile bacterium, can behave as an opportunistic pathogen, with strong adaptive capacity, due to multiple virulence and resistance factors. As a pulmonary infection pathogen in patients with cystic fibrosis (CF), it is related with poor prognosis, increased hospitalizations and high rates of morbidity and mortality, and the eradication is almost impossible, especially after chronicity. The increase rates of isolates non-susceptible to carbapenem and multiple antimicrobials, essentials to therapy, have been observed worldwide. Therefore, we assessed the antimicrobial susceptibility and the presence of hypermutability (HPM) in non-susceptible to carbapenem P. aeruginosa (PANSC) isolates from different morphotypes, obtained from CF patients with chronic pulmonary infection, followed at two reference centers in Rio de Janeiro. Using the results obtained by disk-diffusion test (DDT) between 2007 to 2016, we select 143 PANSC and susceptibility to other antimicrobials was defined, as well as the resistance phenotypes, multi- (MDR), extensive- (XDR) and pandrug resistant (PDR). Additionally, the minimum inhibitory concentration (MIC) for imipenem (IPM), meropenem (MEM), doripenem (DOR) and polymyxin (POL) was determined. Hypermutable isolates were characterized by determination of mutation frequency. Whole genome sequencing (WGS) was performed in six morphotypes isolates, including the small colony variant (SCV), a rare variant phenotype. These isolates were recovered in two exacerbation episodes. Clonality, antimicrobial resistance and virulence were investigated. Of the total (143 isolates) isolated from 18 patients (9 pediatric and 9 adults), non-susceptibility rates above than 44% for gentamicin, amikacin, tobramycin and ciprofloxacin, and more than 30% for POL were observed. Almost all (96%) of the isolates were non-susceptible to IPM by MIC determination, followed by 56% for MEM and 44% for DOR. MIC50 (32 µg/mL) and MIC90 (64 µg/mL) rates for IPM were higher among pediatric patient isolates and 25%, 37% and 6% were MDR, XDR and PDR, respectively. 12% of all isolates were classified as HPM and more than half were categorized as XDR. Using WGS, the six isolates recovered from the clinical case, were identified as a new sequence type (ST2744). Acquired resistance genes blaPAO, blaOXA-50, aph (3')-Iib, fosA, catB7 and crpP and mutations in encoding genes for porins and efflux pumps, was annotated. None exclusive classic genetic markers related to SCV and HPM phenotypes were not observed. This is the first Brazilian report of P. aeruginosa SCV in CF. Our results highlight the importance of epidemiological surveillance in P. aeruginosa. The application of phenotypic and molecular techniques to investigate resistance and virulence mechanisms, can contribute to therapeutic success in CF.

Meropenem Efflux in Pseudomonas aeruginosa at a Tertiary Care Hospital in Jamaica / Eflujo de meropenem en Pseudomonas aeruginosa en un hospital de atención terciaria en Jamaica

ABSTRACT Objective: Several mechanisms account for carbapenem resistance in Pseudomonas (P) aeruginosa which is an emerging problem at a tertiary care hospital (TCH) in Jamaica. The observed pattern of carbapenem resistance that results from efflux mechanisms is unique because it is specific to meropenem (MEM). An investigation of efflux as a mechanism of carbapenem resistance was needed as the information obtained could inform therapeutic and infection control strategies. Methods: At the Microbiology Laboratory of a TCH in Jamaica, from May 2009 to March 2011, of 105 multidrug-resistant Gram-negative bacilli isolated from clinical specimens submitted for routine identification and susceptibility testing, all the MEM-resistant P aeruginosa isolates (a total of 10) were selected. They were tested for efflux using the efflux inhibitor phenylalanine-arginine-β-naphthylamide (PAβN) in a method described by Giske et al in 2008. Results: This study detected evidence of MEM efflux in 80% of MEM-resistant P aeruginosa implicated in nosocomial infections at this TCH in Jamaica, using the PAβN inhibition assay. Meropenem-efflux-positive isolates belonged to two unrelated chromosomal lineages. Conclusion: These results underscored the need for improved surveillance and control to prevent this mechanism from emerging in further P aeruginosa strains.

RESUMEN Objetivo: Varios mecanismos explican la resistencia al carbapenem en Pseudomonas (P) Aeruginosa - un problema que recientemente se está presentando en un hospital de atención terciaria (HAT) en Jamaica. El patrón observado de resistencia al carbapenem que resulta de los mecanismos de eflujo es único, porque es específico del meropenem (MEM). Fue necesario realizar una investigación del eflujo como mecanismo de resistencia al carbapenem, ya que la información obtenida podría usarse para las estrategias de terapia y de control de la infección. Métodos: En el Laboratorio de Microbiología de un HAT en Jamaica, de mayo de 2009 a marzo de 2011, de 105 bacilos gram-negativos polifármacorresistentes aislados de especímenes clínicos presentados para identificación de rutina y pruebas de susceptibilidad, se seleccionaron todos los aislados de P aeruginosa (un total de 10) resistentes a MEM. Estos aislados fueron sometidos a prueba de detección de eflujo, usando el inhibidor de eflujo de fenilalanina-arginina-β-naftilamida (PAβN) en un método descrito por Giske et al en 2008. Resultados: Este estudio detectó evidencia de eflujo de MEM en el 80% de P aeruginosa resistente a MEM implicado en infecciones nosocomiales en este HAT de Jamaica, usando el ensayo de inhibición PAβN. Los aislados positivos al eflujo de meropenem pertenecían a dos linajes cromosómicos no relacionados. Conclusión: Estos resultados subrayaron la necesidad de mejorar la vigilancia y el control para prevenir que este mecanismo vuelva a producirse en nuevas cepas de P aeruginosa.