Efeitos genotóxicos e indução do SOS em mutantes derivados de Escherichia coli K-12 durante o processo de interação com superfícies bióticas e abióticas / Genotoxic and SOS induction in mutants derived from Escherichia coli K-12 during the process of interaction with biotic and abiotic surfaces

A célula epitelial é o primeiro contato entre os micro-organismos e o hospedeiro. Essa interação pode levar a produção de diversas citocinas, quimiocinas, moléculas inflamatórias e também estimular a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Neste trabalho avaliamos se a interação com as células HEp-2 poderia ser genotóxica para os mutantes derivados de Escherichia coli K-12 deficientes em algumas enzimas que fazem parte do sistema de reparo por excisão de base (BER). Além disto, avaliamos a expressão do sistema SOS, que é induzido pela presença de danos no genoma bacteriano. Os resultados obtidos mostraram a presença de filamentos, na interação com células HEp-2, principalmente, no mutante xthA (BW9091) e no triplo mutante xthA nfo nth (BW535). Quando a interação foi quantificada na ausência da D-manose, observamos um aumento das bactérias aderidas. Além disto, a quantidade e o tamanho dos filamentos também aumentaram, mostrando que as adesinas manose-sensíveis estavam envolvidas na filamentação bacteriana. Para comprovar se o aumento da filamentação observada neste ensaio foram uma consequência da indução do sistema SOS, desencadeada pela interação com as células HEp-2, quantificamos a expressão do SOS, na presença e na ausência da D-manose. De fato, observamos que a indução do SOS na ausência da D-manose foi maior, quando comparada, com o ensaio realizado na presença de D-manose. Além disto, observamos que a ausência de xthA foi importante para o aumento da filamentação observada na ausência de D-manose. Diante destes resultados, verificamos se a resposta de filamentação ocorreria quando as bactérias interagiam com uma superfície abiótica como o vidro. Observamos também inúmeros filamentos nos mutantes BER, BW9091 e BW535, quando comparados a cepa selvagem AB1157. Essa filamentação foi associada à indução do SOS, em resposta a interação das bactérias com o vidro...

The epithelial cell is the first contact between microorganisms and host. This interaction results in production of several cytokines, chemokines, and inflammatory molecules by epithelial cells and also stimulate the generation of reactive oxygen species (ROS). In the present study, we have evaluated whether the interaction to HEp-2 cells causes genotoxicity to mutants derived from Escherichia coli K-12 deficient in some enzymes that are part of the system of base excision repair (BER). Moreover, we measured the expression of SOS system, which is induced by the presence of damage to the bacterial genome. Our results showed mainly presence of filamentous bacterial growth in xthA mutant (BW9091) and triple xthA nfo nth mutant (BW535) when submitted to HEp-2 cells interaction assays. When experiments were performed in the absence of mannose, data showed enhanced interaction of viable bacteria to HEp-2 cells for all strains tested. Furthermore, the removal of D-mannose resulted in an increase in both number and size of bacterial filamentous forms, indicating the involvement of mannose-sensitive adhesins in the filamentation of these strains. In order to verify whether the increased filamentation growth in this assay was a consequence of SOS induction, triggered by interaction to HEp-2 cells, we measured expression of SOS in the presence and absence of D-mannose. Indeed, we observed higher expression of SOS response in the absence of mannose than in experiments performed in the presence of D-mannose. Moreover, we observed that the absence of xthA was important to filamentation increasing in absence of D-mannose. Based on these results, we verified if interaction to abiotic surfaces, like glass, could lead to filamentation of these strains. We also observed numerous filaments in BER mutants, BW9091 and BW535, when compared to wild-type strain AB1157. The filamentation observed was a consequence of SOS induction, triggered by attachment to the glass surface...

Cytotoxic and genotoxic investigation on barbatimão [Stryphnodendron adstringens (Mart) Coville, 1910] extract

Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville, 1910 is a small tree, distributed widely throughout the Cerrado region of Brazil and named "barbatimão" by the Tupi-Guarani tribes, which presents astringent properties. Its ethnopharmacological uses comprise, among others, anti-inflammatory and wound healing action, and it is used in the treatment of diarrhea and gynecological problems. The phytotherapeutic use of 'barbatimão' is largely related to its tannin content, which is abundant in its bark. The main goal of the present study was to evaluate the cytotoxic, mutagenic, and genotoxic potential of the lyophilized solution of the stem bark of S. adstringens, using the Ames test, the SOS-Inductest and the SOS-Chromotest. S. adstringens presented cytotoxic activity in all tested systems, did not present mutagenic activity detectable by the Ames test and SOS-Chromotest, and showed some genotoxic effect on the SOS-Inductest. However, the metabolization of the extract by S9 fraction attenuated its genotoxic and cytotoxic activities.

Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville, 1910 é uma pequena árvore amplamente distribuída nas regiões de cerrado do Brasil, chamada de "barbatimão" pelas tribos Tupi-Guarani, que apresenta propriedade adstringente. Seu uso etnofarmacológico compreende, entre outros, efeitos antiinflamatório e cicatrizante, sendo empregada no tratamento de diarréias e problemas ginecológicos. Grande parte das aplicações do fitoterápico de barbatimão está relacionada aos taninos, abundantes em sua casca. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os potenciais citotóxico, mutagênico e genotóxico da solução liofilizada da casca de S. adstringens, utilizando Teste de Ames, SOS-Induteste e SOS-Cromoteste. S. adstringens apresentou atividade citotóxica em todos os sistemas testados, não apresentou atividade mutagênica detectável pelo teste de Ames e SOS-Cromoteste e mostrou certo efeito genotóxico no SOS-Induteste. Porém, a metabolização do extrato pela fração S9 atenuou suas atividades genotóxica e citotóxica.

Patogênese da leptospirose: estudos sobre os fatores envolvidos na virulência e disseminação do agente durnte a infercção no modelo animal de hamster / Pathogenesis of leptospirosis: studies on the factors involved in virulence and spread of the agent durnte infercção in an animal model of hamster

A leptospirose é uma zoonose de importância global e um importante problema de saúde pública principalmente em países em desenvolvimento. É causada por bactérias do gênero Leptospira, uma espiroqueta móvel e de alta morbidade capaz de se disseminar nos tecidos e causar doença crônica em animais hospedeiros. Uma barreira importante para o controle e prevenção da doença tem sido o pouco conhecimento da patogênese do agente, em parte pela falta de ferramentas disponíveis e eficazes de manipulação genética. Um dos objetivos desse estudo foi caracterizar duas cepas mutantes de Leptospira interrogans. A interrupção do gene lipl32, que codifica para a proteína LipL32, a mais abundante proteína no gênero Leptospira e expressa somente na superfície das leptospiras patogênicas, foi realizada através da inserção do transposon Himar1 no sorovar Manilae. A cepa mutante não apresentou nenhuma diferença de crescimento ou de aderência em componentes da matriz celular, comparada com a cepa parental. O mutante foi capaz de produzir doença aguda no modelo animal de hamster e causar colonização crônica no modelo animal de rato, mostrando que LipL32 não possui um papel nestes modelos de infecção. A interrupção do gene ligB foi realizada com a utilização, pela primeira vez em leptospiras patogênicas, da técnica de recombinação homóloga por mutagênese dirigida, onde o gene que codifica para a proteína LigB teve uma parte substituída por um cassete de resistência de espectinomicina (Spcr). Essa proteína, identificada como um possível fator de virulência, reconhecida pelo soro de pacientes infectados e importante para a aderência em componentes da matriz celular, mostrou não ser importante para a infecção aguda ou crônica, quando testada frente aos modelos animais, além de não ser necessária para a aderência em cultura de células. Outro objetivo desse trabalho foi estudar a cinética de disseminação da Leptospira interrogans no modelo animal de hamster, utilizando uma dose alta (108 leptospiras) e baixa (250 leptospiras)de inóculo, além de diferentes rotas de infecção. Nossos resultados demonstraram que leptospiras se disseminam rapidamente em todos os tecidos 01 hora após a infecção com uma alta dose de inóculo e que possivelmente a carga do agente nos tecidos é mais importante para a patogênese do que a sua habilidade para a disseminação. Também demonstramos que a motilidade não é essencial para disseminação, mas pode ser essencial para a carga nos tecidos e letalidade.

Inducing mutations in the mouse genome with the chemical mutagen ethylnitrosourea

When compared to other model organisms whose genome is sequenced, the number of mutations identified in the mouse appears extremely reduced and this situation seriously hampers our understanding of mammalian gene function(s). Another important consequence of this shortage is that a majority of human genetic diseases still await an animal model. To improve the situation, two strategies are currently used: the first makes use of embryonic stem cells, in which one can induce knockout mutations almost at will; the second consists of a genome-wide random chemical mutagenesis, followed by screening for mutant phenotypes and subsequent identification of the genetic alteration(s). Several projects are now in progress making use of one or the other of these strategies. Here, we report an original effort where we mutagenized BALB/c males, with the mutagen ethylnitrosourea. Offspring of these males were screened for dominant mutations and a three-generation breeding protocol was set to recover recessive mutations. Eleven mutations were identified (one dominant and ten recessives). Three of these mutations are new alleles (Otop1mlh, Foxn1sepe and probably rodador) at loci where mutations have already been reported, while 4 are new and original alleles (carc, eqlb, frqz, and Sacc). This result indicates that the mouse genome, as expected, is far from being saturated with mutations. More mutations would certainly be discovered using more sophisticated phenotyping protocols. Seven of the 11 new mutant alleles induced in our experiment have been localized on the genetic map as a first step towards positional cloning.

Biochemical characterization of N-methyl N'-nitro-N-nitrosoguanidine-induced cadmium resistant mutants of Aspergillus niger.

Two cadmium resistant mutants (Cd1 and Cd2) of Aspergillus niger, among the six isolated by mutagenization with N-methyl N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) at pH 6.4 were selected for the study. Analysis of lipid composition of the mutants and the wildtype indicated that total lipid as well as individual lipids of the cadmium resistant mutants were changed as compared with that of the wildtype. The increased activities of metal-lothionein and reduced activities of D-xylose isomerase and L-phenylalanine ammonia lyase in cell free extract of the cadmium resistant mutants suggested that mutants could allow high concentration of cadmium salt as compared with that of the wildtype. The respiratory activity and intracellular as well as extracellular Cd2+ concentration of the mutants reflected the high tolerance of the Cd mutants to cadmium ion.

RAPD analysis of herbicide-resistant Brasilian rice lines produced via mutagenesis

Over the last two decades, mutational techniques have become one of the most important tools available to progressive rice- breeding programs. In a mutation-breeding program initiated in 1999 at the Instituto Agronômico of Campinas, SP, Brazil, a rice line, IAC103, was selected for mutational studies with gamma radiation and ethyl methyl sulfonate mutagenesis, with the aim of developing a herbicide-resistant crop. After mutagenesis, surviving plants were exposed to glufosinate to check for herbicide resistance, which was examined up to the second generation. A detailed RAPD analysis was made of the resistant plants. Eighty Operon technology primers were tested and 10 were selected for a detailed study of RAPD markers that could tag herbicide resistance genes. Resistant and susceptible lines produced variation in the RAPD patterns and certain bands were found only in certain lines. These results suggest genetic ligation that will be confirmed through a genetic segregation study

Diagnostico por mutagenesis dirigida de una mutacion en el gen hMSH2 vinculada a cancer colorrectal hereditario no poliposo / Diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer by directed mutagenesis in a mutation at the hMSH2 gene

El cáncer colorrectal hereditario no poliposo (HNPCC) es la forma más común de cáncer de colon hereditario, y una de las afecciones autosómicas dominantes más frecuentes. Clínicamente se caracteriza por su temprana apacición (< 50 años), la localización proximal de los tumores colónicos y un alto riesgo de desarrollar tumores colorrectales primarios múltiples y extracolónicos. La enfermedad es causada por diferentes mutaciones en alguno de los por lo menos cuatro genes reparadores de discordancias del AND (genes MMR: hMSH2, hHLH1, hPMS1 y hPMS2. Se calcula que afecta a 1:200 1:2000 personas de la población occidental. La identificación de estos genes responsables de HNPCC ha permitido la búsqueda de mutaciones germinales en individuos afectados. En una familia mendocina con cáncer de colon hereditario se realizó la búsqueda del gen afectado a través de un centro holandés de diagnóstico de HNPCC donde detectaron una mutación en el exón 13 del gen hMSH2. La mutación introduce un codón de finalización temprano lo que provoca la expresión de una proteína truncada. Esta mutación en particular no estaba registrada en la base de datos de mutaciones relacionadas con HNPCC. Luego de la detección en el paciente índice, desarrollamos en nuestro laboratorio un procedimiento rápido y eficiente para detectar mutaciones en el resto de los familiares. La metodología consistió en la amplificación del exón 13 del gen hMSH2 mediante un cebador para el extremo 5' que linda con el sitio de la mutación puntual e introduce parte de la secuencia de corte para la enzima Haelll que es completada sólo en el alelo sano. Este análisis genético nos permitió hasta la fecha diagnosticar 17 individuos de los cuales 9 resultaron afectados y están entrando en un programa de seguimiento clínico y consultoría genética.

Mutagênese, carcinogênese e teratogênese: métodos e critérios de avaliaçäo / Mutagenesis, carcinogenesis and teratogenesis: evaluation methods and criterias

O desenvolvimento industrial tem como consequência inevitável a exposiçäo do homem a um número crescente de agentes que constituem um risco para sua saúde. E imprescindível estabelecer normas de uso desses agentes, baseadas em estudos atualizados, capazes de identificar os que tem potencialidades mutagênicas, teratogênicas ou carcinogênicas. A vulnerabilidade do material genético a agressöes impostas pelo ambiente criou uma nova área de pesquisa - a Genética Toxicológica - na qual especialistas em genética, bioquímica, biologia molecular e toxicologia trabalham para estudar as lesöes e alteraçöes induzidas por substâncias químicas. Os ensaios de genotoxidade säo acompanhados de protocolos detalhados e da análise crítica de sua aplicabilidade