Oxidação de resíduos de triptofano em proteínas: formação de ligação cruzada ditriptofano e implicações patofisiológicas / Oxidation of tryptophan residues in proteins: formation of the ditryptophan cross-link and pathophysiological implications

Apesar de extensa investigação das modificações oxidativas irreversíveis sofridas pelas proteínas in vitro e in vivo, os produtos formados pela oxidação de resíduos de triptofano ainda permanecem apenas parcialmente conhecidos. Recentemente, nosso grupo caracterizou uma ligação cruzada de ditriptofano produzida pela recombinação de radicais hSOD1-triptofanila gerados pelo ataque do radical carbonato produzido durante a atividade peroxidásica da enzima superóxido dismutase humana (hSOD1). Neste trabalho, examinamos se a ligação ditriptofano pode ser formada em outras proteínas, além da hSOD1 e por outros oxidantes, além do radical carbonato. A lisozima da clara do ovo e a beta cristalino bovina foram utilizadas como alvos de oxidação. A lisozima foi utilizada por ser uma enzima pequena (129 aminoácidos) e de estrutura bem conhecida, contendo seis resíduos de Trp. Os resultados mostraram que o radical carbonato, gerado enzimatica ou fotoliticamente, promove a oxidação, dimerização e inativação da lisozima. Os principais produtos de oxidação caracterizados por análise de nano-ESI-Q-TOF-MS/MS foram hidroxi-triptofano e N-formilquinurenina juntamente com um dímero de lisozima (lisozima-Trp28-Trp28-lisozima) e um hetero dímero lisozima-hSOD1 (lisozima-Trp28-Trp32-hSOD1), ambos ligados por uma ligação ditriptofano. Também demonstramos que a irradiação da lisozima com luz UVC leva à formação do dímero lisozima-Trp28-Trp28-lisozima. Em consequência, resolvemos tratar a beta cristalino bovina com radical carbonato gerado fotoliticamente ou com luz UVC, e a proteína também sofreu oxidação, dimerização e agregação. Os principais produtos de oxidação caracterizados por nano-ESI-Q-TOF-MS/MS foram hidroxi-triptofano, N-formilquinurenina, DOPA e um dímero de beta cristalino (ßB2-Trp151-Trp151-ßB2). A irradiação com luz UVC também levou à formação de um dímero intra-cadeia, caracterizado como ßA2-Trp78-Trp81. Quando a beta cristalino foi irradiada com um simulador de luz solar (UVA e UVB) também foi possível observar um dímero, caracterizado como ßA2-Trp150-Trp150-ßA2. A presença de produtos de oxidação de resíduos de Trp, dentre eles a ligação cruzada ditritpofano, também foi avaliada in vivo, utilizando o cristalino de pacientes que foram submetidos a cirurgia para remoção de catarata. Beta, alfa e gama cristalino foram as principais proteínas identificadas nas frações solúvel e insolúvel do cristalino. A principal modificação pós-traducionais identificada foi deamidação. Um alto conteúdo de resíduos de metionina e triptofano oxidados foram identificados nas proteínas presentes na fração insolúvel. Os principais produtos de oxidação de Trp identificados por nano-ESI-Q-TOF-MS/MS foram quinurenina e N-formilquinurenina. A presença de dímeros covalentes no cristalino com catarata foi confirmada por análises de massas. A completa caracterização desses dímeros (ßB1-Trp127-Trp127-ßB1 e ßB1-Trp193-Trp193-ßB1) confirmou que as cadeias polipeptídicas foram ligadas por uma ligação ditriptofano. Em síntese, nossos dados demonstraram que o radical carbonato e a luz UV podem produzir dímeros de ditriptofano em diferentes proteínas. Também, a presença da ligação cruzada de ditriptofano in vivo (catarata humana) foi pela primeira vez detectada

Despite extensive investigation of irreversible oxidative modifications suffered by proteins in vitro and in vivo, the products formed by oxidation of tryptophan residues remain partially characterized. Our group recently described a ditryptophan cross-link produced by recombination of hSOD1-tryptophanyl radicals generated by attack of the carbonate radical produced during the peroxidase activity of the human superoxide dismutase (hSOD1) enzyme. Here, we examine whether the ditryptophan cross-link can be produced in others proteins besides the hSOD1 and by other oxidants, in addition to the carbonate radical. The egg white lysozyme and bovine beta crystalline were used as targets. Lysozyme was used because it is a small enzyme (129 amino acids) with a well-known structure, containing six Trp residues. The results showed that the carbonate radical, generated enzymatically or photolytically, promotes lysozyme oxidation, inactivation and dimerization. The major oxidation products characterized by nano-ESI-Q-TOF-MS/MS analysis were hydroxy-tryptophan and N-formylkynurenine together with a dimer of lysozyme (lysozyme-Trp28-Trp28-lysozyme) and a hetero dimer hSOD1-lysozyme (lysozyme-Trp28-Trp32-hSOD1), both bound by a ditryptophan cross-link. Also, it was demonstrated that lysozyme irradiation with UVC light leads to the formation of the dimer lysozyme-Trp28-Trp28-lysozyme. In view of these results, we decided to treat beta crystalline bovine with photolytically generated carbonate radical and UVC. Beta crystalline also suffered oxidation, dimerization and aggregation. The major oxidation products characterized were hydroxy-tryptophan, N-formylkynurenine, DOPA and a beta crystalline dimer (ßB2-Trp151-Trp151-ßB2) by nano-ESI-Q-TOF-MS/MS. Irradiation with UVC light also led to the formation of an intra-chain dimer, which was characterized as ßA2-Trp78-Trp81. When beta crystalline was irradiated with a solar simulator (UVA and UVB), it was also possible to observe a dimer which was characterized as ßA2-Trp150-Trp150-ßA2. The presence of oxidized tryptophan products, including the ditryptophan cross-link, was also evaluated in vivo in the lenses of patients submitted to cataract removal. Beta, alpha and gamma crystalline were the main proteins identified in soluble and insoluble fractions of the lenses. The main post translational modification identified was deamidation. A high content of oxidized methionine and tryptophan residues were identified in proteins present in the insoluble fraction. The main tryptophan oxidation products identified by nano-ESI-Q-TOF-MS/MS were kynurenine and N-formylkynurenine. The presence of covalent dimers in the lenses with cataract was demonstrated by mass analysis. Full MS/MS characterization of the dimers ßB1-Trp127-Trp127-ßB1 and ßB1-Trp193-Trp193-ßB1 confirmed that they were linked by a ditryptophan bond. In summary, our data demonstrate that the carbonate radical and UV light can produce ditryptophan dimers in different proteins. Also, the presence of the ditryptophan cross-link was first detected in vivo (human cataract)

Comparación de tecnologías de oxidación (TAO´s) para la degradación del pesticida Mertect / Comparison of oxidation technologies (TAO’s) for pesticide degradation Mertect

El presente trabajo tuvo como objetivo realizar la comparación de tecnologías avanzadas de oxidación (TAO´s) para la degradación del pesticida Mertect. Para el diseño experimental del trabajo se empleó un fotoreactor. La degradación del pesticida se determinó mediante espectrofotometría ultravioleta/visible, método que permitió determinar que los procesos fotoquímicos basados en la fotocatálisis heterogénea con dióxido de titanio – TiO2 y los procesos de fotocatálisis homogénea con hierro (III) permiten obtener porcentajes de remoción significativos del pesticida superiores al 99.0 y al 95.0 respectivamente, lo que permite concluir que los procesos de oxidación avanzados son adecuados para la remoción y degradación del pesticida Mertect.

El papel de la inflamación en la aterogénesis: revisión / Role of inflammation in atherogenesis: review

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria de la pared arterial que involucra los mecanismos de la inmunidad celular y humoral. La disfunción del endotelio vascular y la retención de lipoproteínas en la íntima arterial, han sido señalados como los eventos más tempranos en la aterogénesis, promoviendo la liberación de citoquinas y quimoquinas que contribuyen al reclutamiento de leucocitos. Los proteoglicanos de la íntima arterial, retienen y modifican las lipoproteínas aumentando su tasa de fagocitosis en macrófagos, mediada en su mayoría por los receptores scavenger clase A y clase B en el caso de las lipoproteínas oxidadas (LDLox), provocando la producción de citoquinas como el Factor de Necrosis Tumoral (TNF)-a, Interleuquina (IL)-1b, IL-6, IL-12 e IL-18, entre otras, que permiten la activación de células T en linfocitos T cooperadores (Th1), capaces además de reconocer como autoantígenos epítopes específicos sobre las LDLox y las Proteínas de Shock Térmico, amplificándose así la respuesta inflamatoria. Los macrófagos que han internalizado lipoproteínas, se transforman en células espumosas, que acumuladas en la íntima arterial constituyen las estrías de grasas, primera etapa de la aterosclerosis. Dada la relevancia biológica y clínica de estos eventos, esta revisión pretende brindar información reciente, concerniente a las reacciones inflamatorias envueltas en el establecimiento de la placa aterosclerótica por medio de evidencias extraídas a partir de estudios experimentales que involucran el papel fisiológico de los leucocitos y su interacción con los componentes de la matriz extracelular, además de destacar los principales biomarcadores inflamatorios relacionados con la prognosis de eventos cardiovasculares.

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial wall, where both cellular and humoral immunity mechanisms are involved. Vascular endothelial dysfunction and lipoproteins retention into the arterial intima have been reported as the earliest events in atherogenesis, promoting cytokines and chemokines releases; both responsible of leukocytes recruitment. Arterial proteoglycans retain and modify the lipoproteins, increasing their phagocytosis into macrophages through class A and class B scavenger receptors in the case of oxidized lipoproteins (LDLox), causing the production of cytokines like Tumoral Necrosis Factor (TNF)- a, Interleukin (IL)-1 b, IL-6, IL-12 and IL-18, among others. This secretion generates T cells activation into T helper lymphocytes (Th1), able to recognize the LDLox and heat shock protein as autoantigens, amplifying the inflammatory response. Macrophages that have uptaken lipoproteins become foam cells and their accumulation produces the formation of fatty streaks, the first step into atherosclerosis. Due to the biological and clinical importance of these events, the purpose of the present review is to offer recent information on the inflammatory reactions that occur around the establishment of the atheromatous plaque, exhibiting experimental evidences of the physiologic role of leukocytes and their interaction with the extracellular matrix. Furthermore, to emphasize about the major inflammatory biomarkers on the prognosis of cardiovascular diseases.