Análise do instestino médio de Aedes fluviatilis (LUTZ, 1904) normal e infectado com o Plasmodium gallinaceum (BRUMPT, 1935): um estudo estrutural e ultraestrutural

A malária é uma das mais importantes doenças parasitárias do mundo, sendo considerada um dos principais problemas de saúde pública. Estudos morfológicos foram realizados com o objetivo de melhor estudar, ao longo de vários órgãos simultaneamente, os aspectos da infecção do Plasmodium gallinaceum no vetor experimental Aedes fluviatilis. Foram realizados experimentos para acompanharmos a cinética de desenvolvimentos dos oocistos pela microscopia óptica (MO), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia laser confocal (M.L.C). Observamos que a distribuição dos oocistos ocorre de maneira aleatória e assincrônica ao longo do intestino médio o que nos permitiu diferenciar o seu grau de maturidade. Os oocistos que apresentaram uma parede rugosa foram considerados por nós como sendo ainda jovens; aqueles com a parede lisa já em estágio de desenvolvimento, avançado e maduros. Detectamos também a presença de hemócitos aderidos à superfície dos oocistos ao longo da infecção, mostrando assim que estes são reconhecidos talvez como corpos estranhos. Acompanhamos também a liberação dos esporozoítos na hemocele, bem como sua localização em várias partes do mosquito até a sua invasão nas células secretoras da glândula salivar do Ae. fluviatilis no oitavo dia de infecção. Estudando a interação dos oocinetos do P. gallinaceum com intestino do Ae. fluviatilis, observamos a adesão do parasito nas microvilosidades com a posterior invasão das células claras, de maneira semelhante ao já observado para o Ae. aegypti

Tal fato sugere ser um artefato, uma vez que o epitélio intestinal, ao ser processado in vitro, ocasionou alterações de algumas células tornando-as semelhantes às células de Ross, sem microvilosidades e que se projetam acima do epitélio, sendo preferencialmente invadidas pelos oocinetos, quando observadas pela M.O e M.E.V. Estudos de interação in vivo realizados pela M.L.C. permitiram-nos epitélio em direção à membrana basal. Visualizamos uma grande alteração do citoesqueleto das células invadidas com a destruição das microvilosidades e deslocamento do núcleo e a sua posterior expulsão após o posicionamento do oocineto na base da membrana basal. A seguir, esse espaço é preenchido pelas células vizinhas e o epitélio reconstituído

Análise do instestino médio de Aedes fluviatilis (LUTZ, 1904) normal e infectado com o Plasmodium gallinaceum (BRUMPT, 1935): um estudo estrutural e ultraestrutural / Analysis of the medium intestine of Aedes fluviatilis (Lutz, 1904) normal and infected with Plasmodium gallinaceum (Brumpt, 1935): a structural and ultrastructural

A malária é uma das mais importantes doenças parasitárias do mundo, sendo considerada um dos principais problemas de saúde pública. Estudos morfológicos foram realizados com o objetivo de melhor estudar, ao longo de vários órgãos simultaneamente, os aspectos da infecção do Plasmodium gallinaceum no vetor experimental Aedes fluviatilis. Foram realizados experimentos para acompanharmos a cinética de desenvolvimentos dos oocistos pela microscopia óptica (MO), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia laser confocal (M.L.C). Observamos que a distribuição dos oocistos ocorre de maneira aleatória e assincrônica ao longo do intestino médio o que nos permitiu diferenciar o seu grau de maturidade. Os oocistos que apresentaram uma parede rugosa foram considerados por nós como sendo ainda jovens; aqueles com a parede lisa já em estágio de desenvolvimento, avançado e maduros. Detectamos também a presença de hemócitos aderidos à superfície dos oocistos ao longo da infecção, mostrando assim que estes são reconhecidos talvez como corpos estranhos. Acompanhamos também a liberação dos esporozoítos na hemocele, bem como sua localização em várias partes do mosquito até a sua invasão nas células secretoras da glândula salivar do Ae. fluviatilis no oitavo dia de infecção. Estudando a interação dos oocinetos do P. gallinaceum com intestino do Ae. fluviatilis, observamos a adesão do parasito nas microvilosidades com a posterior invasão das células claras, de maneira semelhante ao já observado para o Ae. aegypti. Tal fato sugere ser um artefato, uma vez que o epitélio intestinal, ao ser processado in vitro, ocasionou alterações de algumas células tornando-as semelhantes às células de Ross, sem microvilosidades e que se projetam acima do epitélio, sendo preferencialmente invadidas pelos oocinetos, quando observadas pela M.O e M.E.V. Estudos de interação in vivo realizados pela M.L.C. permitiram-nos epitélio em direção à membrana basal. Visualizamos uma grande alteração do citoesqueleto das células invadidas com a destruição das microvilosidades e deslocamento do núcleo e a sua posterior expulsão após o posicionamento do oocineto na base da membrana basal. A seguir, esse espaço é preenchido pelas células vizinhas e o epitélio reconstituído.

Susceptibilidade e resposta imune humoral do hospedeiro natural Gallus gallus domesticus a esporozoítas de Plasmodium gallinaceum (Brumpt, 1935)

Investigou-se a susceptibilidade da galinha doméstica, hospedeiro natural do Plasmodium gallinaceum (Pg), aos esporozoítas inoculados por diferentes vias, bem como a sua capacidade de produzir anticorpos anti-esporozoítas. Aves de uma ou três semanas de idade foram inoculadas com esporozoítas pela picada de Aedes Fluviatilis, pela via subcutânea (s.c.) ou intravenosa(i.v.) e as parasitemias acompanhadas através de esfregaços sanguíneos diários. Nas aves de uma semana inoculadas pela picada de Aedes ocorreu 100 por cento de infecção, enquanto nas aves de três semanas ocorreu variação de 40 a 100 por cento, proporcional ao número de fêmeas alimentadas. A inoculação de esporozoítas pela seringa resultou em 100 por cento de infecção. O período pré-patente (PPP) da malária foi menor na inoculação i.v., no entanto, a idade da ave não influenciou o PPP. Aves mais jovens tiveram maiores parasitemias e mortalidades. Nos soros coletados após a primoinoculação, anticorpos anti-esporozoítas foram detectados pela imunofluorescência indireta (IFI) nos dias 7 e 14 após inoculação, declinando na terceira semana.Na Elisa com esporozoítas isolados de mosquitos, os soros foram positivos a partir da terceira semana. Nas três reinoculações de esporozoítas, os títulos de anticorpos atingiram um platô após o segundo inóculo. As aves inoculadas pelas tr~es vias apresentaram títulos similares ao final das reinoculações, embora as que foram inoculadas pela picada apresentaram maior aumento no título de anticorpos. Pelas análises de western-blot com sedimento ou antígenos solúveis de esporozoítas, a proteína circumesporozoíta (cs) foi reconhecida pelos soros de aves inoculadas por qualquer das três vias utilizadas, a partir da segunda semana após inoculação. Outras proteínas de variados pesos moleculares foram também reconhecidas, algumas pertencentes a antígenos obtidos de Aedes não infectados, entre elas uma proteína de 7 kda.

No modelo aviário, o hospedeiro natural produziu anticorpos contra os antígenos de esporozoítas com elevados títulos e prevalência, tendo a proteína CS confirmado a sua imunogenicidade. A possível presença de anticorpos protetores nos soros de aves expostas aos esporozoítas e o estudo das diferenças qualitativas entre os esporozoítas inoculados pela picada e seringa, suas conseqüencias na interação parasita-hospedeiro e resposta imune subseqüente necessitam ser melhor estudadas no futuro.

Susceptibilidade e resposta imune humoral do hospedeiro natural Gallus gallus domesticus a esporozoítas de Plasmodium gallinaceum (Brumpt, 1935) / Susceptibility and humoral immune response of the natural host Gallus gallus domesticus the sporozoite of Plasmodium gallinaceum (Brumpt, 1935)

Investigou-se a susceptibilidade da galinha doméstica, hospedeiro natural do Plasmodium gallinaceum (Pg), aos esporozoítas inoculados por diferentes vias, bem como a sua capacidade de produzir anticorpos anti-esporozoítas. Aves de uma ou três semanas de idade foram inoculadas com esporozoítas pela picada de Aedes Fluviatilis, pela via subcutânea (s.c.) ou intravenosa (i.v.) e as parasitemias acompanhadas através de esfregaços sanguíneos diários. Nas aves de uma semana inoculadas pela picada de Aedes ocorreu 100 por cento de infecção, enquanto nas aves de três semanas ocorreu variação de 40 a 100 por cento, proporcional ao número de fêmeas alimentadas. A inoculação de esporozoítas pela seringa resultou em 100 por cento de infecção. O período pré-patente (PPP) da malária foi menor na inoculação i.v., no entanto, a idade da ave não influenciou o PPP. Aves mais jovens tiveram maiores parasitemias e mortalidades. Nos soros coletados após a primoinoculação, anticorpos anti-esporozoítas foram detectados pela imunofluorescência indireta (IFI) nos dias 7 e 14 após inoculação, declinando na terceira semana. Na Elisa com esporozoítas isolados de mosquitos, os soros foram positivos a partir da terceira semana. Nas três reinoculações de esporozoítas, os títulos de anticorpos atingiram um platô após o segundo inóculo. As aves inoculadas pelas três vias apresentaram títulos similares ao final das reinoculações, embora as que foram inoculadas pela picada apresentaram maior aumento no título de anticorpos. Pelas análises de western-blot com sedimento ou antígenos solúveis de esporozoítas, a proteína circumesporozoíta (cs) foi reconhecida pelos soros de aves inoculadas por qualquer das três vias utilizadas, a partir da segunda semana após inoculação. Outras proteínas de variados pesos moleculares foram também reconhecidas, algumas pertencentes a antígenos obtidos de Aedes não infectados, entre elas uma proteína de 7 kda. No modelo aviário, o hospedeiro natural produziu anticorpos contra os antígenos de esporozoítas com elevados títulos e prevalência, tendo a proteína CS confirmado a sua imunogenicidade. A possível presença de anticorpos protetores nos soros de aves expostas aos esporozoítas e o estudo das diferenças qualitativas entre os esporozoítas inoculados pela picada e seringa, suas conseqüencias na interação parasita-hospedeiro e resposta imune subseqüente necessitam ser melhor estudadas no futuro.

Resistência do Aedes fluviatilis (Lutz, 1904) ao Bacillus thruringiensis israelensis (Goldberg e Margalit, 1977) e a infecção pelo Plasmodium gallinaceum (Brumpt, 1935)

A família Culicidae é de fundamental importância médica porque transmite vários patógenos ao homem incluindo aqueles que causam a malária. O Aedes fluviatilis infectado com Plasmodium gallinaceum tem sido usado como modelo para estudar a interação entre os parasitas da malária e os mosquitos vetores. Foi analisado o uso do Bacillus thuringiensis var. isralensis (B.t.i.), da resistência aos inseticidas convencionais e dos problemas no meio ambiente causado pelo seu uso prolongado. Contudo, poucos estudos têm considerado o potencial de resistência dos insetos aos patógenos naturais. Para verificar essa possibilidade e entender como o B.t.i. pode afetar a taxa de infecção da malária no mosquito vetor em áreas tratadas, foi testada a habilidade vetorial da população de Ae. fluviatilis selecionada para resistência em condições laboratoriais. Em nossos bioensaios, a DL50 apresentou um aumento de 7,5 vezes de resistência na 2° geração (F2). Os intestinos médios de adultos tratados com B.t.i. e processados para SDS-PAGE não demonstraram a presença de uma banda 206 kDa presente nos mosquitos adultos não tratados com o patógeno.

A análise estatística de Ae. fluviatilis tratados e não tratados com B.t.i. infectados com P. gallinaceum e insetos não tratados infectados não mostraram diferenças significativas nas taxas de infecção, avaliadas pelo número de oocistos presentes nos intestinos médios. A análise dos estômagos dos mosquitos revelou que os perfis moleculares, obtidos pela análise de LS-PCR dos indivíduos não tratados diferem dos daqueles insetos expostos ao B.t.i., já que a LS-PCR amplificou uma banda de aproximadamente 620 pb nos mosquitos controles. Esses perfis se mantiveram os mesmos tanto para um indivíduo quanto para os “pools”, na microvilosidade dos intestinos de adultos e larvas tratados com B.t.i. Portanto, o Ae. fluviatilis exposto ao B.t.i. exibiu certas alterações bioquímicas, fisiológicas, e moleculares e de resistência, porém os nossos estudos não foram capazes de demonstrar alteração na capacidade vetorial.

Resistência do Aedes fluviatilis (Lutz, 1904) ao Bacillus thruringiensis israelensis (Goldberg e Margalit, 1977) e a infecção pelo Plasmodium gallinaceum (Brumpt, 1935) / Resistance of Aedes fluviatilis (Lutz, 1904) to Bacillus thruringiensis israelensis (Goldberg and Margalit, 1977) and infection by Plasmodium gallinaceum (Brumpt, 1935)

A família Culicidae é de fundamental importância médica porque transmite vários patógenos ao homem incluindo aqueles que causam a malária. O Aedes fluviatilis infectado com Plasmodium gallinaceum tem sido usado como modelo para estudar a interação entre os parasitas da malária e os mosquitos vetores. Foi analisado o uso do Bacillus thuringiensis var. isralensis (B.t.i.), da resistência aos inseticidas convencionais e dos problemas no meio ambiente causado pelo seu uso prolongado. Contudo, poucos estudos têm considerado o potencial de resistência dos insetos aos patógenos naturais. Para verificar essa possibilidade e entender como o B.t.i. pode afetar a taxa de infecção da malária no mosquito vetor em áreas tratadas, foi testada a habilidade vetorial da população de Ae. fluviatilis selecionada para resistência em condições laboratoriais. Em nossos bioensaios, a DL50 apresentou um aumento de 7,5 vezes de resistência na 2° geração (F2). Os intestinos médios de adultos tratados com B.t.i. e processados para SDS-PAGE não demonstraram a presença de uma banda 206 kDa presente nos mosquitos adultos não tratados com o patógeno. A análise estatística de Ae. fluviatilis tratados e não tratados com B.t.i. infectados com P. gallinaceum e insetos não tratados infectados não mostraram diferenças significativas nas taxas de infecção, avaliadas pelo número de oocistos presentes nos intestinos médios. A análise dos estômagos dos mosquitos revelou que os perfis moleculares, obtidos pela análise de LS-PCR dos indivíduos não tratados diferem dos daqueles insetos expostos ao B.t.i., já que a LS-PCR amplificou uma banda de aproximadamente 620 pb nos mosquitos controles. Esses perfis se mantiveram os mesmos tanto para um indivíduo quanto para os “pools”, na microvilosidade dos intestinos de adultos e larvas tratados com B.t.i. Portanto, o Ae. fluviatilis exposto ao B.t.i. exibiu certas alterações bioquímicas, fisiológicas, e moleculares e de resistência, porém os nossos estudos não foram capazes de demonstrar alteração na capacidade vetorial.