Busca por alvos de regulação pelo segundo mensageiro c-diGMP em Pseudomonas aeruginosa / Search for c-di-GMP regulation targets in Pseudomonas aeruginosa

Recentemente, o bis-(3',5')-di-guanosina monofosfato cíclico (c-di-GMP) surgiu como uma importante molécula sinalizadora nas bactérias. Essa molécula foi identificada como uma das responsáveis pelo controle do comportamento bacteriano e está relacionada com a patogenicidade e a adaptação de diversas bactérias, coordenando a expressão de genes envolvidos com virulência, motilidade e formação de biofilme. O mecanismo pelo qual c-diGMP atua vem sendo motivo de estudo de vários grupos de pesquisa nos últimos anos. Já foi demonstrado o papel dessa molécula em diferentes etapas do controle da expressão gênica. Acredita-se que a manipulação dos níveis de c-di-GMP pode ser uma nova abordagem terapêutica contra bactérias patogênicas. Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria do grupo gama, que atua como um patógeno oportunista, causando infecções em pacientes imunocomprometidos, sendo o maior causador de infecções crônicas em pacientes portadores de fibrose cística. O genoma de P. aeruginosa PA14 apresenta vários genes que codificam proteínas envolvidas no metabolismo e/ou ligação de c-di-GMP, o que pode indicar um amplo papel regulatório deste nucleotídeo nessa bactéria. Uma associação infundada entre níveis elevados de c-di-GMP e a resistência aos antibióticos é geralmente assumida, já que altos níveis de c-di-GMP levam à formação de biofilme, que é comprovadamente um modo de crescimento mais resistente. Nesse trabalho, utilizando uma abordagem proteômica, mostramos que Pseudomonas aeruginosa PA14 regula a expressão de cinco porinas em resposta a variações nos níveis de c-di-GMP, independentemente dos níveis de mRNA. Uma dessas porinas, OprD, é responsável pela entrada do antibiótico ß-lactâmico imipenem na célula e é menos abundante em condições de alto c-di-GMP. Também demonstramos que linhagens com altos níveis de c-di-GMP apresentam uma vantagem competitiva de crescimento em relação a linhagens com níveis mais baixo de c-di-GMP quando crescidas em meio contendo imipenem. Em contraste, observamos que células planctônicas com elevados níveis c-di-GMP são mais sensíveis a tobramicina. Em conjunto, estes resultados mostram que c-di-GMP pode regular a resistência a antibióticos em sentidos opostos, e independentemente do crescimento em biofilme

Following the genomic era, a large number of genes coding for enzymes predicted to synthesize and degrade 3'-5'-cyclic diguanylic acid (c-di-GMP) was found in most bacterial genomes and this dinucleotide emerged as an important intracellular signal molecule controlling bacterial behavior. Diverse molecular mechanisms have been described as targets for c-di-GMP, but several questions remain to be addressed. An association between high c-di-GMP levels and antibiotic resistance is largely assumed, since high c-di-GMP upregulates biofilm formation and the biofilm mode of growth leads to enhanced antibiotic resistance; however, a clear understanding of this correlation is missing. Pseudomonas aeruginosa is a versatile gamma-proteobacterium that behaves as an opportunistic pathogen to a broad range of hosts. The ability of P. aeruginosa to form biofilms contributes to its virulence and adaptation to different environments. The P. aeruginosa PA14 genome presents several genes encoding proteins involved in metabolism or binding to c-di-GMP, which may indicate a wide regulatory role of this nucleotide in this bacterium. Here, using a proteomic approach, we show that Pseudomonas aeruginosa PA14 regulates the amount of five porins in response to c-di-GMP levels, irrespective of their mRNA levels. One of these porins is OprD, decreased in high c-di-GMP conditions, which is responsible for the uptake of the ß-lactam antibiotic imipenem. We also demonstrate that this difference leads strains with high c-di-GMP to be more resistant to imipenem even when growing as planktonic cells, giving them a competitive advantage over cells with low c-di-GMP. Contrastingly, we found that planktonic cells with high c-di-GMP levels are more sensitive to aminoglycosides antibiotics. Together, these findings show that c-di-GMP levels can regulate the antibiotic resistance to different drugs in opposite ways and irrespective of a biofilm mode of growth

Porinas e suas ações imunomoduladoras dependentes de TLR2 / Porins and their immunomodulatory effects triggered by TLR2

Os micro-organismos podem infectar seu hospedeiro por diferentes vias, sendo a principal o trato respiratório. O reconhecimento pela mucosa dessas vias pode desencadear inibição da proliferação e bloqueio da entrada microbiana, assim como estimular resposta direcionada a memória imunológica para prevenir posteriores infecções. Alguns micro-organismo, como as bactérias Neisseria meningitidis e Neisseria lactamica, são capazes de modular a resposta imune de mucosa diretamente, ou por meio das células epiteliais respiratórias. Este trabalho propôs, então, a avaliação das porinas B provenientes destas bactérias como moduladoras da produção de IL-8 nas linhagens BEAS-2B e Detroit 562. Também foi avaliada a dependência deste estímulo ao receptor TLR2. Ambas as porinas se ligaram a TLR2 e por este receptor estimularam a produção de IL-8. O perfil de produção foi dependente da expressão de TLR2 pelas células. A porina lactâmica induziu menos IL-8 por regular negativamente a expressão de TLR2, mas sua afinidade pelo receptor se mostrou maior que a da porina meningocócica. As porinas são então moduladoras das células de mucosa, fato que somado a atividade adjuvante destas proteínas por via parenteral estimulou a avaliação destas como adjuvantes de mucosa. O modelo escolhido para a avaliação foi o de inoculação intranasal de camundongos, utilizando como antígeno o lipopolissacarídio pouco imunogênico de Franciscella tularensis atenuada (Ft-LPS). A análise foi baseada no título de anticorpos IgG e IgM séricos. A porina meningocócica se mostrou a mais imunogênica, mas por ser originária de patógeno acarreta maior risco biológico em sua produção. Para viabilizar a porina meningocócica como adjuvante, a mesma foi substituída por porina homóloga produzida de modo recombinante em Escherichia coli não patogênica. A porina recombinante foi avaliada pelo mesmo sistema in vivo e comparada a adjuvantes experimentais de ação conhecida (rCTB, QS-21 e ODN 1826). A porina apresentou...

Microorganisms can invade the host through many routes, specially the respiratory tract. The respiratory mucosa is responsible for recognition, inhibition, proliferation and entry blockade of microorganisms, besides incitation of immunological memory to prevent further infections. Some microorganisms, such as Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica, can modulate the mucosa immune response directly or through stimulation of respiratory epithelial cells. The present work proposed the evaluation of porin B proteins, derived from these microorganisms, as modulators of IL-8 production on respiratory epithelial cell strains BEAS-2B and Detroit 562. TLR2 receptor dependency for the modulation was also evaluated. Both porins bounded to TLR2 and through this receptor were able to stimulate IL-8 production, whereas this profile was correlated with TLR2 expression. Lactamica porin (Nlac PorB) induced less IL-8 and TLR2 expression, also for a shorter period of time. The effect caused by Nlac PorB was attributed to TLR2 down regulated expression, since its binding affinity to the receptor is greater than meningococcal porin (Nmen PorB). Porins were therefore able to immune modulate mucosal cells, fact that allied with their parenteral adjuvant activity incited evaluation of porins as potential mucosal adjuvants. The model chosen for the evaluation was intranasal immunization of mice, using as the antigen a low immunogenic lipopolysaccharide extracted from attenuated Franciscella tularensis (Ft-LPS). The evaluation was based on IgG and IgM serum titers. After the immunization scheme, Nmen PorB induced higher IgG and IgM titers than Nlac PorB. Although Nmen PorB was more efficient, it comes from a pathogen. To overcome the risk of its production, it was replaced by recombinant porin (rPorB) produced by Escherichia coli. rPorB was evaluated by the same model and compared with well known experimental adjuvants (rCTB, QS-21 e ODN 1826). rPoB had the highest IgM and IgG...