Identificação de novos antagonistas para receptores purinérgicos P2 / Identification of new antagonists for P2 purinergic receptors

Os receptores purinérgicos P2 são receptores expressos na membrana plasmática de diversos tipos celulares humanos, nos quais exercem importantes funções fisiológicas . Eles são divididos em duas classes, de acordo com a estrutura apresentad a . A classe P2X comp reende os subtipos de receptores ionotrópicos que são ativados fisiologicamente pelo ATP. Dentre os receptores P2X, o P2X7 destaca se por suas funções associadas à dor e à inflamação. Já a classe P2Y compreende os subtipos de receptores metabotrópicos, os quais são ativados por diferentes nucleotídeos extracelulares. Nes s a última classe, o subtipo P2Y2 destaca se p elos seus papeis desempenhados na inflamação e no câncer, enquanto o P 2Y4 se sobressai pela escassez de informações acerca de suas funções fisiol ógicas devido a limitações de caráter farmacológico . Apesar de serem considerados importantes alvos terapêuticos , ainda não existe m fármacos com atuação sobre ess es receptores que sejam aprovados para uso clínico , o que encoraja a busca por novas moléculas com atividade antagonista. Ness e contexto, o objetivo des t e estudo foi identificar novos antagonistas para receptores P2 (P2X7, P2Y2 e P2Y4) e averiguar se eles exercem algum papel n a atenuação da dor e inflamação Na primeira part e dess e trabalho foi identificada a atividade antagonista d o extrato galhos de Joannesia princeps Vell. após a realização de uma mini campanha de triagem. Utilizando a técnica de mensuração de cálcio intracelular, foi demonstrado que esse extrato foi capaz de inibir a mobiliza ção de cálcio induzida por UTP de forma concentração dependente, sendo que esse efeito não foi provocado por citotoxicidade ou fenômeno quenching. (AU)

Além disso, esse extrato também foi capaz de inibir parcialmente a mobilização de cálcio induzida por UDP . Co m isso , os resultados sugerem uma possível seletividade quanto à ação antagonista desse extrato sobre os receptores P2Y ativados por nucleotídeos derivados da uridina. Enquanto isso, na segunda parte do trabalho foi identificada a atividade antagonista d a molécula CS 15 sobre o receptor P2X7 durante a realização de uma mini campanha de triagem . A molécula CS 15 , um triterpeno isolado da planta Clusia studartiana C. M. Vieira & Gomes da Silva foi capaz de inibir a captação do corante YO PRO 1 em ensaios de permeabilização celular de forma concentração dependente e apresentou um IC 50 na faixa de nanomolar. A demais , ess a molécula não demonstrou toxicidade in vitro e ainda foi capaz de aliviar os sintomas de nocicepção em modelo experimental animal. Coletivamen te, os resultados apontam para a descoberta de novos antagonistas para receptores P2 de origem natural , os quais podem contribuir no futuro para o escasso campo da terapia associada aos receptores purinérgicos. (AU)

Three Gaseous Neurotransmitters, Nitric oxide, Carbon Monoxide, and Hydrogen Sulfide, Are Involved in the Neurogenic Relaxation Responses of the Porcine Internal Anal Sphincter

BACKGROUND/AIMS: The internal anal sphincter (IAS) plays an important role in maintaining continence and a number of neurotransmitters are known to regulate IAS tone. The aim of this study was to determine the relative importance of the neurotransmitters involved in the relaxant and contractile responses of the porcine IAS. METHODS: Responses of isolated strips of IAS to electrical field stimulation (EFS) were obtained in the absence and presence of inhibitors of neurotransmitter systems. RESULTS: Contractile responses of the sphincter to EFS were unaffected by the muscarinic receptor antagonist, atropine (1 muM), but were almost completely abolished by the adrenergic neuron blocker guanethidine (10 muM). Contractile responses were also reduced (by 45% at 5 Hz, P carbon monoxide > hydrogen sulfide.

Padronização da triagem de alto desempenho de antagonistas para receptores purinérgicos ativados por UTP a partir da mensuração de cálcio intracelular / Standardization of the screening of high performance antagonists For receivers purinergic activated by UTP from Measurement of calcium intracellular

Os receptores purinérgicos são proteínas expressas na membrana plasmática de diversos tiposcelulares e são ativadas por purinas e pirimidinas extracelulares. Eles são classificados emreceptores P1 e P2, de acordo com o tipo de ligante fisiológico, entretanto, os P2R são aindasubdivididos nas classes: P2XR, que abrange os subtipos ionotrópicos e P2YR, que agrupa ossubtipos acoplados à proteína G. Dentre os P2YR, os subtipos P2Y2 e P2Y4 vem sendoamplamente estudados em virtude de suas funções sobre diversos sistemas biológicos. Umavez ativados pelo UTP, estes receptores promovem a ativação e inibição de canais iônicos,controlam o fluxo de íons através da membrana, induzem um aumento de cálcio intracelular,além de estimular a proliferação celular. Em vista disso, muitos grupos de pesquisa já vemestudando o P2Y2 e o P2Y4 como alvos terapêuticos para o tratamento de diversas doenças,tais como fibrose cística, doença do olho seco, doença de Alzheimer, entre outras. Entretanto,a escassez de moléculas com propriedade antagonista seletiva sobre estes receptores dificultao avanço da caracterização de novos papéis funcionais associados a eles, e neste contexto, osprodutos naturais podem atuar como uma importante fonte para a descoberta de compostosque apresentem a característica almejada. Por isso, o objetivo deste trabalho foi padronizaruma metodologia de mensuração de cálcio intracelular induzido pelo UTP em células dalinhagem de macrófagos murinos J774.G8 e realizar a triagem de extratos oriundos deprodutos naturais a fim de identificar compostos com atividade antagonista sobre o P2Y2R eo P2Y4R. Para isso, foi padronizado um protocolo de carregamento celular com o indicadorde cálcio Fluo-4AM com posterior leitura dos sinais de cálcio no FlexStation III em células J774.G8...

The purinergic receptors are proteins expressed in plasma membrane of many cell types thatare activated by extracellular purines and pyrimidines. They are classified in P1 and P2receptors, according to physiological ligand. However, the P2R are further subdivided in twoclasses: P2X for ionotropic subtypes and P2Y for G-protein coupled ones. Among P2YR, theP2Y2 and P2Y4 subtypes has been widely studied due to their functions in many biologicalsystems. Once activated by UTP, these receptors promote the activation and inhibition of ionchannels, control the flow of ions through the membrane, induce an increase of intracellularcalcium and stimulate the cell proliferation. In view of this, many research groups have beenstudying the P2Y2 and P2Y4 as therapeutic targets for the treatment of several diseases likeCystic Fibrosis, Dry Eye Disease, Alzheimer, among others. However, the lack of moleculeswith selective antagonist property on these receptors difficults the advancement ofcharacterization of new functional roles associated with them, and in this context, naturalproducts may act as an important source for the discovery of compounds that present thisdesired feature. Therefore, the aim of this study was to standardize a methodology formeasurement of intracellular calcium mobilization induced by UTP in a murine macrophagecell line J774.G8 and perform the screening of extracts derived from natural products in orderto identify compounds with antagonist activity on the P2Y2R and P2Y4R. For this, it wasstandardized a protocol of cell labeling with calcium indicator Fluo-4AM in J774.G8 cellswith subsequent detection of calcium signals in FlexStation III...

Triagem de extratos vegetais e fúngicos de diferentes biomas para identificação de antagonistas do receptor P2X7 / Screening of plant and fungal extracts of various biomass for the identification of P2X7 receptor antagonists

O P2X7 é um receptor purinérgico que está envolvido em importantes funções fisiológicase metabólicas, mas também tem participação em diversas patologias, principalmente aquelas decaráter inflamatório. Apesar de sua relevância, ainda não se têm disponíveis antagonistasespecíficos que possam ser utilizados na clínica para o tratamento de doenças relacionadas àativação deste receptor. Muitos fármacos comercializados nos dias de hoje apresentam estruturasquímicas relacionadas a um produto natural extraído de alguma espécie botânica de uso consagradona medicina popular. Baseia-se nisso a relevância do estudo de produtos naturais para obtenção deuma atividade específica sobre alvos celulares. Logo, esse trabalho teve como interesse o estudo deextratos vegetais e fúngicos obtidos de espécies dos diferentes biomas, cedidos pelo LQPN doCentro de Pesquisas René Rachou – Fiocruz-MG, visando á identificação de antagonistas para oreceptor P2X7. Nosso primeiro passo foi à padronização de uma metodologia que permitiu atriagem de cerca de 60 extratos ao mesmo tempo, através da utilização de um espectrofotômetro deplacas. Depois de padronizada, promovemos a aplicação dessa metodologia na triagem de 1800extratos, dos quais apenas três extratos (8067,8549 e 8568) apresentaram atividade antagonista nafaixa de corte pré-estabelecida [100 mig/mL], com perfis de inibição de 65 por cento, 62 por cento e 61 por centorespectivamente, sobre o P2X7R. Destes extratos foram determinados os IC´s50 tanto em células delinhagem murina (2,1 mig/mL; 2.6 mig/mL e 3.8 mig/mL) quanto em células de linhagem humana(0.69, 0.92 e 1.5 mig/mL), sendo possível verificar maior atividade quando testados em células delinhagem humana...

Inhibitory Effect of Purinergic Antagonists to the Electrically Stimulated Contraction of Canine Detrusor Muscle / 대한비뇨기과학회지

Cholinergic neurotransmission plays a major role in the postganglionic nerve evoked contractile response of the urinary bladder, but there is atropine-resistant contraction that is not completely blocked by atropine and may be related with nonadrenergic-noncholinergic (NANC) neurotransmission. Among the NANC neurotransmission, adenosine triphosphate(ATP) is an important transmitter in purinergic neurotransmission which is known to many vertebrates including human beings. The aim of this study is to determine the role and existence of purinergic neurotransmission in the canine detrusor muscle. In vitro contractile responses to electrical stimulation after pretreatment with atropine were measured in the presence of purinergic antagonist such as theophylline, b, r-methylene ATP and verapamil. Field stimulation( frequency 0.5-40 Hz; pulse width l ms; 10V square wave) produced a contraction that was abolished by tetrodotoxin( 0.1uM) and reduced by 42.5% after atropine ( 10uM) pretreatment. The contractile response was reduced by 44.1%, 30.3% and 60.1 % after the treatment of theophylline( 1uM, 10uM and 100uM) in the presence of atropine, 11.1%, 22.7% and 30.3% after the treatment of b, r-methylene ATP ( 5uM, 50uM and 500uM) and 17.6%, 39.4% and 60.1 % after the treatment of verapamil( 0.1u M, 1uM and 10uM) at 20 Hz frequency. These reduced contractile responses were statistically significant (p <0.05), especially in higher concentration, and relatively frequency-dependent and verapamil decreased the contractile response most significantly. These data demonstrate that purinergic neurotransmission is related to the contraction of canine detrusor muscle. On the other hand contractile responses were persisted after pretreatment of higher dose antagonist, which suggests that another mechanism such as peptidergic mechanism be related to the contraction of canine detrusor muscle.