Use of antioxidants and time of cold storage: effects over viability parameters and enzymatic levels in semen of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum, 1792) / Uso de antioxidantes e tempo de armazenamento a frio: efeitos sobre parâmetros de viabilidade e níveis enzimáticos no sêmen da truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum, 1792)

Abstract The cold storage of milt implies potentials alterations in its quality because the storage generates as main process, free radicals that produce spermatozoa membrane lipids damage with the consequent motility and fertilising capacity disruptions. To decrease the damage generated by free radicals the cells have antioxidant defences (proteins, enzymes, and low molecular weight substances). The objective of the present study evaluated the time storage effect and different antioxidants prepared in spermatic diluents on sperm viability of O. mykiss milt stored at 4°C. The two-way ANOVA denoted that the time storage and antioxidant influence have significant effects separated or combined on viability parameters (sperm motility and viability, proteins concentrations and superoxide dismutase enzymatic activity in seminal plasma). In contrast, only the storage time affected the fertilising capacity and catalase enzymatic activity in seminal plasma. The resulting analysis can conclude that the antioxidant presence improves the viability of cold stored milt, especially the transport conditions and the antioxidants allow the fecundity despite motility decrease.

Resumo O armazenamento a frio de leite implica potenciais alterações em sua qualidade, pois gera como processo principal radicais livres que provocam danos aos lipídios da membrana dos espermatozoides, com as consequentes alterações na motilidade e na capacidade de fertilização. Para diminuir os danos causados pelos radicais livres, as células têm defesas antioxidantes (proteínas, enzimas e substâncias de baixo peso molecular). O presente estudo avaliou o efeito do tempo de armazenamento e diferentes antioxidantes preparados em diluentes espermáticos no armazenamento de viabilidade de O. mykiss milt a 4°C. A ANOVA de duas vias denotou que o armazenamento no tempo e a influência antioxidante têm efeitos significativos separados ou combinados nos parâmetros de viabilidade (motilidade espermática, viabilidade espermática, concentrações de proteínas e atividade enzimática da superóxido dismutase no plasma seminal), enquanto apenas o tempo de armazenamento afetou a capacidade de fertilização e atividade enzimática da catalase no plasma seminal. A análise resultante pode concluir que a presença de antioxidante melhora a viabilidade do leite frio, especialmente as condições de transporte, e os antioxidantes permitem a fecundidade apesar da diminuição da motilidade.

Effects of genistein supplementation on the characteristics of human sperm during liquid storage

Cryopreservation, the most popular way to preserve human sperm, led to a significant decline in sperm motility. Here, we tried to introduce a new method to store sperm without freezing. Different concentrations of genistein were added to liquid preserved sperm. We investigated the effects of supplementation on sperm total antioxidative capacity (T-AOC), glutathione(GSH), methane dicarboxylic aldehyde (MDA), acrosomal enzyme activity, and fertilization ability of sperm. The effects of liquid storage and cryopreservation on sperm parameters were also compared. IVF medium supplemented with genistein (20µmol L-1 ) maintained sperm motility for up to 11 days. The addition of genistein led to a decrease in reactive oxygen species (ROS) generation that demonstrated an effective improvement in sperm motility and decreased the MDA production and maintained the GSH content and enhanced the oxidative stress resistance ability of the sperm during liquid storage. The storage sperm were used for intracytoplasmic sperm injection(ICSI) into human oocytes and activated oocytes successfully. Sperm stored in liquid medium containing genistein was superior to sperm stored in liquid nitrogen in terms of antioxidant stress and fertilization ability. We confirmed that genistein could be used as an antioxidant for the liquid storage of sperm. Sperm stored in an IVF medium with genistein could avoid cryodamage, which may become an alternative option in assisted reproduction technology. (Afr J Reprod Health 2022; 26[7]: 72-82)

Use of cooled buffalo semen as a strategy to increase conception rates in fixed-time artificial insemination programs during unfavorable reproductive periods / [Uso de sêmen resfriado de búfalo como estratégia para aumentar as taxas de concepção em programas de inseminação artificial em tempo fixo, durante períodos reprodutivos desfavoráveis]

The objective of this study was to compare the reproductive efficiency of dairy buffaloes undergoing fixed-time artificial insemination (FTAI) protocols based on progesterone/estrogen (P4/E2) and eCG during unfavorable breeding season using cooled (CS) and frozen semen (FS). A total of 446 buffaloes (> 40 days postpartum) were randomly distributed into four blocks (years): B1-2014 (n = 143), B2-2015 (n = 34), B3-2016 (n = 90), and B4-2017 (n = 179). Each block was subdivided into two (AI with CS and FS using the same ejaculate of each bull). Thus, the block subdivision was as follows: B1 (CS = 71 and FS = 72); B2 (CS = 18 and FS = 16); B3 (CS = 47 and FS = 43); and B4 (CS = 90 and FS = 89). The ejaculates of eight Murrah bulls collected using an artificial vagina were divided into two aliquots: one aliquot was diluted in Botu-Bov® commercial extender and cooled (BB-CS), and the other was diluted in the same extender and frozen (BB-FS). BB-CS aliquots were cooled at 5 °C/24 h using a refrigerator. BB-FS group aliquots were also cooled, and after equilibrating at 5 °C for 4 h, were placed in a 21-L Styrofoam box, 5 cm above the surface of liquid nitrogen. In the afternoon (A) on D0 (2:00 p.m.) the animals received EB 2.0 mg IM (Estrogin®) and an ear implant (CRESTAR® 3.0 mg P4). At D9 (A), the implant was removed, and the animals received eCG 400 IU IM (Folligon® 5000) + Cloprostenol PGF2α 0.530 mg IM (Sincrocio®). At D10 (A), the animals received EB 1.0 mg IM (Estrogin®), and at D12 (8:00 a.m.), AI was performed. At D42, pregnancy was diagnosed via ultrasonography. Total CRs were 48.2% CS and 34.6% FS for years 2014 to 2017, with a significant difference of 13.7% (P<0.05). In conclusion, cooled semen resulted in higher CR than frozen semen in dairy buffaloes under the P4/E2 and eCG FTAI during the unfavorable reproductive season.(AU)

O objetivo deste estudo foi comparar a eficiência reprodutiva de búfalas leiteiras submetidas a protocolos de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) à base de progesterona/estrogênio (P4/E2) e eCG, durante a estação reprodutiva desfavorável, usando-se sêmen resfriado (SR) e congelado (SC) Um total de 446 búfalas (> 40 dias após o parto) foi distribuído aleatoriamente em quatro blocos (anos): B1-2014 (n = 143), B2-2015 (n = 34), B3-2016 (n = 90) e B4-2017 (n = 179). Cada bloco foi subdividido em dois (IA com SR e SC utilizando-se a mesma ejaculação de cada touro). Assim, a subdivisão do bloco foi a seguinte: B1 (SR = 71 e SC = 72); B2 (SR = 18 e SC = 16); B3 (SR = 47 e SC = 43); e B4 (SR = 90 e SC = 89). Os ejaculados de oito touros Murrah coletados com vagina artificial foram divididos em duas alíquotas: uma alíquota diluída em diluente comercial Botu-Bov® e resfriada (BB-SR), e a outra diluída no mesmo diluente e congelada (BB-SC). As alíquotas de BB-SR foram resfriados a 5°C/24h usando-se um refrigerador. As alíquotas do grupo BB-SC também foram resfriadas e, após equilíbrio a 5°C por 4h, foram colocadas em uma caixa de isopor de 21L, 5 cm acima da superfície do nitrogênio líquido. À tarde (A), no D0 (14h), os animais receberam BE 2,0 mg IM (Estrogin®) e um implante auricular (Crestar® 3,0 mg P4). No D9 (A), o implante foi retirado e os animais receberam eCG 400 UI IM (Folligon® 5000) + cloprostenol PGF2α 0,530 mg IM (Sincrocio®). No D10 (A), os animais receberam BE 1,0mg IM (Estrogin®), e, no D12 (8h da manhã), foram realizadas as IAs. No D42, a gestação foi diagnosticada por ultrassonografia. As taxas de concepção (TC) totais foram 48,2% SR e 34,6% SC para os anos de 2014 a 2017, com uma diferença significativa de 13,7% (P<0,05). Em conclusão, o sêmen resfriado resultou em maior TC do que o sêmen congelado em bubalinos leiteiros sob P4/E2 e eCG FTAI durante a estação reprodutiva desfavorável.(AU)

Glutathione and IGF-1 in bovine seminal cryopreservation: oxidative stress response and pregnancy rate / [Glutationa e IGF-1 na criopreservação seminal bovina: resposta do estresse oxidativo e taxa de gestação]

The objective of this study was to evaluate the rate of conception, metabolic, and structural conditions of cryopreserved bovine sperm cells, plus extender with IGF-1 and glutathione (GSH). 12 ejaculations of Nelore bulls were used, submitted to treatments: control, gSH (2mM/mL), IGF-1 (100ng/mL) and gSH (1mM/mL) + IGF-1 (50ng/mL). After cryopreservation and thawing the semen passed the fast thermo resistance test (TTR), plasma membrane and acrosomal integrity (PIAI), mitochondrial membrane potential (AP), oxidative stress, and conception rate. Tukey test was used for the statistical analysis of the parametric variables and the Friedman test for nonparametric. The gestation percentage was compared by the Chi-square test. There was no statistical difference (P<0.05) between treatments for the TTRr variable. Otherwise in the oxidative stress evaluated with the CellROX probe was noted that the IGF-1 showed the highest number of reactive cells (P<0.05). The PIAI, AP and gestation rate showed no difference among treatments (P>0.05), with an average of conceptions of 36.58%. It is concluded that IGF-1, gSH and their association did not cause changes in sperm motility, mitochondrial potential, plasma and acrosomal membrane integrity. IGF-1 increased oxidative stress, however, there was no difference in the gestation rate among the treatments.(AU)

Objetivou-se avaliar a taxa de concepção, as condições metabólicas e estrutural das células espermáticas bovinas criopreservadas, acrescidas de diluidores com fator de crescimento semelhante à insulina do tipo 1(IGF-1) e glutationa (GSH). Foram utilizados 12 ejaculados de touros da raça Nelore, submetidos aos tratamentos: controle, gSH (2mM/mL), IGF-1 (100ng/mL) e gSH (1mM/mL) + IGF-1 (50ng/mL). Após a criopreservação e descongelação, o sêmen passou pelos testes de termorresistência rápida (TTRr), integridade de membrana plasmática e acrossomal (PIAI), alto potencial mitocondrial (AP), estresse oxidativo e taxa de concepção. Utilizou-se o teste de Tukey para as análises estatísticas das variáveis paramétricas e o teste de Friedman para as não paramétricas, com significância de 5%. A percentagem de gestação foi comparada pelo teste do qui-quadrado. Não hove diferença estatística (P<0,05) entre os tratamentos para a variável TTRr. Já no estresse oxidativo avaliado com a sonda CellROX, observou-se que o IGF-1 apresentou maior quantidade de células reativas (P<0,05), 36,38± 24,10. A PIAI, o AP e a taxa de gestação não apresentaram diferença entre tratamentos (P>0,05), com média de concepções de 36,58%. Conclui-se que o IGF-1, a gSH e a sua associação não causaram mudanças na motilidade espermática, no potencial mitocondrial, na integridade da membrana plasmática e acrossomal. O IGF-1 aumentou o estresse oxidativo, porém sem diferença na taxa de gestação entre os tratamentos.(AU)

Effect of egg yolk-based extender and seminal plasma removal on sperm viability of cooled donkey semen / Efeito do diluente à base de gema de ovo e remoção do plasma seminal na viabilidade espermática do sêmen refrigerado de jumento

Developing effective cooled semen protocols is essential to increase pregnancy rates and reproductive efficiency in donkeys. This study aimed to evaluate the effect on sperm kinetic parameters and membrane integrity in cooled donkey semen diluted with defined milk proteins extender with 1% or 2% of egg yolk and the removal of seminal plasma. Twenty-four ejaculates from six jackasses were collected. Each ejaculate was divided into four aliquots that were diluted in extender with 1% (EY1) or 2% (EY2) egg yolk. One sample from each group was centrifuged, seminal plasma was removed (CEY1, CEY2 groups, respectively), and the samples were then refrigerated at 5 °C for 24 h. Fresh and cooled semen samples were assessed for sperm motility, morphology, and plasma membrane integrity. Total motility, progressive motility, sperm kinetic parameters, or live sperm cells were not statistically different when semen was cooled with an extender supplemented with 1% or 2% of egg yolk. Seminal plasma removal does not affect total motility or sperm kinetic parameters. However, progressive motility decreased (P<0.05) when semen was extended with 2% of egg yolk and seminal plasma was removed. Membrane integrity was affected (P<0.05) in centrifuged samples. In conclusion, the obtained results suggest that there is no difference in sperm kinetics and membrane integrity when 1% or 2% of egg yolk was added to the Equiplus extender. Also, the removal of seminal plasma by centrifugation did not have any beneficial effect on cooled donkey semen. Further studies are needed to relate these results with in vivo fertility tests with cooled donkey semen.(AU)

O desenvolvimento de protocolos de sêmen resfriado eficazes é essencial para aumentar as taxas de prenhez e eficiência reprodutiva em jumentos. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito do diluente à base de proteínas do leite com 1 ou 2% de gema de ovo sobre os parâmetros cinéticos do sêmen e integridade da membrana em sêmen resfriado de jumento, com ou sem a remoção do plasma seminal. Vinte e quatro ejaculados de seis jumentos foram coletados. Cada ejaculado foi dividido em quatro alíquotas e diluído em diluente com 1% (EY1) ou 2% (EY2) de gema de ovo. Uma amostra por grupo foi centrifugada e o plasma seminal removido (grupos CEY1 e CEY2, respectivamente). Os pellets foram novamente ressuspendidos nas mesmas concentrações e diluentes. Em seguida, as quatro alíquotas foram refrigeradas a 5°C por 24 horas. Amostras de sêmen fresco e refrigerado foram avaliadas quanto à motilidade espermática e integridade da membrana plasmática. Motilidade total, motilidade progressiva, parâmetros de cinética espermática ou células espermáticas vivas não apresentaram diferença significativa quando o sêmen foi resfriado com diluente suplementado com 1% ou 2% de gema de ovo. A remoção do plasma seminal não afetou a motilidade total ou os parâmetros de cinética espermática; entretanto, a motilidade progressiva diminuiu (P<0,05) quando o sêmen foi diluído com 2% de gema de ovo e o plasma seminal removido. Nas amostras centrifugadas, a integridade da membrana foi afetada (P<0,05). Em conclusão, os resultados sugerem que não há diferença na cinética espermática e na integridade da membrana quando 1% ou 2% de gema de ovo são adicionados ao diluente Equiplus e a remoção do plasma seminal por centrifugação não teve nenhum efeito benéfico no resfriamento de sêmen de jumento. Mais estudos são necessários para relacionar esses resultados com testes de fertilidade in vivo com sêmen resfriado em jumentos.(AU)

Effects of chelating calcium in cryopreservation extender on frozen-thawed dog semen / [Efeitos da quelação de cálcio no meio de criopreservação no sêmen descongelado de cão]

We evaluated the effect of reducing free calcium in the cryopreservation medium, using the calcium chelator ethylene diamine tetracetic acid (EDTA) at 0.3% and 0.5% concentrations. Three male mixed breed dogs were subjected to semen collection by digital manipulation (n=16). Each ejaculate was divided in three aliquots, and each one was diluted in TRIS-glucose-egg yolk extender with 6% glycerol and 0.5% Equex STM Paste® (TGE, control); and added with 0.3% EDTA (EDTA 0.3) or 0.5% EDTA (EDTA 0.5). Calcium concentration reduced in EDTA 0.3 and all the calcium ions were chelated in EDTA 0.5. The EDTA addition did not affect sperm morphology or plasma membrane integrity; however, by removing all free calcium (EDTA 0.5), the sperm motility reduced (64.7% in TGE and 45% in EDTA 0.5; p<0.05). Acrosome integrity and sperm binding ability were not improved by calcium chelation. The failure to prevent the premature AR may explain why sperm longevity was not affected by calcium removal. Thus, the partial or complete calcium removal, through EDTA addition, is not able to prevent acrosomal damage or premature acrosomal reaction, and therefore does not improve the dog sperm binding ability.(AU)

Avaliou-se o efeito da redução do cálcio livre no meio de congelamento, usando-se o quelante de cálcio etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,3% e 0,5%. Três cães machos sem raça definida foram submetidos à coleta de sêmen por manipulação digital (n=16). Cada ejaculado foi diluído em diluidor controle com TRIS-glicose - gema de ovo (TGE, controle), ou em diluidor TGE enriquecido com 0,3% (EDTA 0,3) ou 0,5% de EDTA (EDTA 0,5). A concentração de cálcio reduziu no meio EDTA 0,3, e todos os íons de cálcio foram quelados no meio EDTA 0,5. A adição do EDTA e a consequente quelação do cálcio não afetaram a morfologia espermática ou a integridade da membrana plasmática, no entanto, ao remover todo o cálcio do meio (EDTA 0,5), a motilidade espermática se reduziu (64,7% no TGE e 45% no EDTA 0,5; P<0,05). A integridade do acrossoma e a capacidade de ligação do espermatozoide não melhoraram com a quelação do cálcio. Apesar da influência da concentração de cálcio sobre a motilidade espermática após o descongelamento, a falha em prever a reação acrossomal prematura pode explicar por que a longevidade espermática não foi afetada pela remoção do cálcio no meio. Dessa forma, a remoção parcial ou total do cálcio, por meio da adição de EDTA, não é capaz de prevenir o dano no acrossoma ou a reação acrossomal prematura e, portanto, não aumenta a capacidade do espermatozoide de se ligar ao oócito.(AU)

Protein profile as a quality indicator of cryopreserved semen from Tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) / Perfil protéico como indicador qualitativo do semen criopreservado de Tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818)

Abstract The aim of this study was to evaluate the association between proteins in the seminal plasma of tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) with seminal quality indicators after thawing. The semen was cryopreserved with a dilution based on BTS with 8% DMSO. A 200 µL sample of semen from each animal was diluted in 800 µL BTS, centrifuged at 800 rpm, and the supernatant was cryopreserved to further analyze of the protein profile of seminal plasma through one-dimensional electrophoresis (SDS-PAGE). After 15 days of cryopreservation, a cryopreserved semen straw was thawed to analyze both qualitative and quantitative parameters. When considering all collections, the SDS-PAGE identified 15 protein bands in the seminal plasma of tambaqui. When the interaction (presence or absence) between proteins observed in the seminal plasma and the post thawed spermatic parameters was evaluated, we observed a great influence of the presence of proteins on spermatic quality. A greater (P<0.05) fertilization rate was observed with the presence of proteins 12, 34, 44, 85, and 90 kDa. Proteins in seminal plasma of tambaqui influenced the spermatic quality after thawing, and thus, they can be utilized as an indicator of sperm quality, especially the proteins with a molecular weight ≤ 50 kDa.

Resumo O objetivo desse estudo foi de avaliar a associação entre a presença de proteínas no plasma seminal do tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) com indicadores de qualidade seminal pós-descongelamento. O semen foi criopreservado com diluidor a base de BTS com 8% DMSO. Uma amostra de 200 µL de semen de cada animal foi diluída em 800 µL de BTS, e centrifugada em 800 rpm, e somente o sobrenadante foi criopreservado para posterior análise do perfil proteico do plasma seminal, através da eletroforese unidimensional (SDS-PAGE). Decorridos 15 dias da criopreservação, uma palheta com semen criopreservado foi descongelado para análise dos parâmetros quali-quantitativos. Considerando todas as coletas, o SDS-PAGE identificou 15 bandas proteicas no plasma seminal do tambaqui. Quando se avaliou a interação (presença ou ausência) das proteínas encontradas no plasma seminal, com os parâmetros espermáticos pós-descongelamento, observou-se grande influência da presença das proteínas na qualidade espermática. Observou-se maior taxa de fertilização (P<0,05) com a presença das proteínas 12, 34, 44, 85 e 90 kDa. As proteínas do plasma seminal de tambaqui influenciaram na qualidade espermática após descongelamento, podendo ser utilizadas como indicadores para a qualidade espermática após descongelamento, principalmente as proteínas com peso molecular ≤50 kDa.

Effectiveness of tes-tris or tris association with low density lipoprotein on in vitro longevity of refrigerated buffalo semen / Eficácia da associação TES-TRIS ou TRIS com lipoproteína de baixa densidade sobre a longevidade in vitro de sêmen refrigerado de búfalos

This study investigated in vitro the efficacy of four different extenders (TES-TRIS and TRIS with LDL low-density lipoprotein at concentrations of 10 or 5%) on the longevity of buffalo sperm in the refrigeration process at 5ºC. Sperm motility was assessed every 24 hours up to 72 hours of incubation using computer assisted sperm analysis and sperm membrane integrity was examined by the hypoosmotic test (HOST) at T1, T24, T48 and T72 hours. Eleven buffaloes (1 ejaculate per buffalo) of the Murrah breed were used, ranging in age from 4 to 5 years. Immediately after collection, each ejaculate was fractionated into 4 aliquots, and each aliquot was diluted in one of four diluents to obtain 50x106SPTZ/mL. The samples were packed in 0.5mL straws and refrigerated (-0.25°C/min) to 5°C and maintained at this temperature until evaluation. Prior to evaluation the samples were heated at 37°C for 30 seconds. The statistical package used for analysis was STATA 12.0 "Statistical Analysis Software" and means were compared by the Friedman test (P<0.05). The results of sperm kinetics and HOST indicate that the TRIS diluent with 10% LDL could be a promising alternative for semen refrigeration at 5ºC, to be used in conventional and fixed time artificial insemination.(AU)

Este estudo investigou in vitro a eficácia de quatro diferentes extensores (TES-TRIS e TRIS com lipoproteína de baixa densidade - LDL, nas concentrações de 10 ou 5%) sobre a longevidade espermática de búfalos no processo de refrigeração a 5ºC. A motilidade espermática foi avaliada a cada 24 horas até 72 horas de incubação, por sistema computadorizado "CASA", e a integridade de membrana espermática foi examinada pelo teste hiposmótico (HOST) em T1, T24, T48 e T72 horas. Foram utilizados 11 búfalos (um ejaculado por búfalo) da raça Murrah, com idade variando de quatro a cinco anos. Imediatamente após a coleta, cada ejaculado foi fracionado em quatro alíquotas, e cada alíquota foi diluída em um dos quatro diluidores para a obtenção de 50x106 SPTZ/mL. As amostras foram envasadas em palhetas de 0,5 mL, refrigeradas (-0,25oC/minuto) até 5oC e mantidas nessa temperatura até a avaliação. Previamente à avaliação, as amostras foram aquecidas a 37oC por 30 segundos. O pacote estatístico utilizado para as análises foi o STATA 12.0 "Statistical Analysis Software", e as médias foram comparadas pelo teste de Friedman (P<0,05). Os resultados de cinética e HOST até o tempo de 48 horas indicam que o diluidor TRIS com 10% LDL seria uma alternativa promissora para a refrigeração do sêmen a 5ºC, a ser utilizado na inseminação artificial e na inseminação artificial em tempo fixo.(AU)

Effect of refrigeration at -1°C on spermatozoa quality of domestic cats / Efeito da refrigeração a -1°C na qualidade de espermatozoides de gatos domésticos

The objective of this study was to evaluate the sperm quality obtained of domestic cats by electroejaculation and recovery of the tail of the epididymis after cooling at -1°C and 4°C for 24 and 48 hours. Twenty-nine adult cats (2 to 6kg) were used. Sperm collection was performed by electroejaculation (EEJ), and after 48 hours, the cats were orchiectomized, and sperm sample was obtained from the vas deferens and epididymis tail (EPD). The samples were diluted in ACP-117® extender, and the sperm characteristics were evaluated at three different moments: when still fresh, 24 and 48 hours after cooling. The objective of this study was to evaluate the sperm quality obtained of domestic cats by electroejaculation and recovery of the tail of the epididymis after cooling at -1°C and 4°C for 24 and 48 hours. Twenty-nine adult cats (2 to 6kg) were used. Sperm collection was performed by electroejaculation (EEJ), and after 48 hours, the cats were orchiectomized, and sperm sample was obtained from the vas deferens and epididymis tail (EPD). The samples were diluted in ACP-117® extender, and the sperm characteristics were evaluated at three different moments: when still fresh, 24 and 48 hours after cooling. In order to compare the two refrigeration temperatures, the first stage was to analyze if there was a difference between the harvesting techniques. After this, two experiments were conducted: in the first, sperm sample from 14 cats were used and the cooling was performed at -1°C; and in the second, sample from 15 cats were used and the sperm were refrigerated at 4°C. Sperm kinetics were evaluated by computerized analysis (CASA) and concentration by Neubauer chamber, spermatic morphology was evaluated by modified Karras staining, and membrane integrity was evaluated by eosin nigrosine. The results obtained were analyzed in R software, version 3.2.5 using the Mann-Whitney test for variables with abnormal distributions, considering significance at the level of 5%. In ejaculate samples, higher values of total morphological defects were observed after 24 and 48 hours of refrigeration at 4°C (P<0.022) compared to refrigeration at -1°C, using Friedman test. To quantify the decrease in sperm quality, parameter reductions were calculated among time points (F-24h/F-48h/24h-48h). In EPD samples, a greater reduction in sperm quality was detected after 24 hours of refrigeration at 4°C, both in motility and sperm kinetics and in the movement and velocity indices, compared to refrigeration at -1°C. Based on the results, it can be concluded that cooling of feline spermatozoa at -1°C for up to 48 hours was efficient in maintaining spermatic quality collected by EEJ and EPD, and it could be an alternative to spermatozoa cryopreservation in domestic felines.(AU)

O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade espermática de gatos domésticos obtidos por eletroejaculação e recuperação da cauda do epidídimo após a refrigeração a -1°C e a 4°C por 24 e 48 horas. Vinte e nove gatos adultos (2 a 6kg) foram utilizados. A colheita de espermatozoides foi realizada por eletroejaculação (EEJ) e, após 48 horas, os gatos foram orquiectomizados, e as amostras espermáticas foram obtidas a partir do ducto deferente e da cauda do epidídimo (EPD). As amostras foram diluídas em ACP-117® e as características espermáticas foram avaliadas em três momentos distintos: fresco, 24 e 48 horas após a refrigeração. Para ser possível comparar as duas temperaturas de refrigeração, a primeira etapa foi analisar se havia diferença entre as técnicas de colheita. Após isto, dois experimentos foram conduzidos: no primeiro, espermatozoides de 14 gatos foram utilizados e a refrigeração foi realizada a -1°C; e no segundo, amostras de 15 gatos foram utilizados e os espermatozoides foram refrigerados a 4°C. A cinética espermática foi avaliada por análise computadorizada (CASA), a concentração por câmara de Neubauer, a morfologia espermática foi avaliada pela coloração de Karras modificada, e a integridade da membrana foi avaliada por eosina nigrosina. Os resultados obtidos foram analisados no software R, versão 3.2.5, utilizando o teste de Mann-Whitney para variáveis com distribuições anormais, considerando significância ao nível de 5%. No ejaculado, maiores valores de defeitos morfológicos totais foram observados após 24 e 48 horas de refrigeração a 4°C (P<0,022) em comparação com refrigeração a -1°C, usando o teste de Friedman. Para quantificar a diminuição na qualidade espermática, as reduções dos parâmetros foram calculadas entre os pontos de tempo (F-24h/F-48h/24h-48h). Na EPD, uma maior redução na qualidade espermática foi detectada após 24 horas de refrigeração a 4°C, tanto na motilidade e na cinética espermática quanto nos índices de movimento e velocidade, em comparação com a refrigeração a -1°C. Com base nos resultados, pode concluir-se que a refrigeração dos espermatozoides felino a -1°C, até 48 horas, foi eficaz na manutenção da qualidade espermático colhidos por EEJ e EPD, e pode ser uma alternativa para a criopreservação de espermatozoides em felinos domésticos.(AU)

Does supplementation of vitamin C, reduced glutathione or their association in semen extender reduce oxidative stress in bovine frozen semen? / A suplementação de vitamina C, glutationa reduzida ou sua associação no diluidor de sêmen reduz o estresse oxidativo no sêmen congelado bovino?

The aim of this study was to evaluate the addition of vitamin C, reduced glutathione and the association thereof to the bovine semen cryopreservation extender. The ejaculate from nine bulls were divided into four fractions, each corresponding to a treatment, namely: control group-semen diluted with Tris-yolk extender; vitamin C group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with vitamin C (2.5mmol/mL); glutathione group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with reduced glutathione (2.5mmol/mL) and associated group-semen diluted in Tris-yolk extender supplemented with vitamin C (1.25mmol/mL) and reduced glutathione (1.25mmol/mL). Afterwards, the semen was packed into French straws and submitted to cryopreservation using automated equipment. After cryopreservation, the semen was thawed and evaluated considering sperm motility, morphology, plasma membrane, acrosome, mitochondrial potential and oxidative stress, as well as the thermo resistance test. Extender's supplementation with the association of vitamin C and reduced glutathione showed benefic effects on sperm motility and preservation of plasma and acrosomal membranes during semen cryopreservation, being also the group that showed higher values of reactive oxygen species. Thus, the association of both antioxidants contributed to the preservation of sperm cells in every analyzed characteristic, suggesting its use on bovine semen cryopreservation.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar a adição de vitamina C, glutationa reduzida e sua associação ao diluidor de criopreservação de sêmen bovino. O ejaculado de nove touros foi dividido em quatro frações, cada uma correspondendo a um tratamento, a saber: grupo controle - sêmen diluído em Tris-gema; grupo vitamina C - sêmen diluído em Tris-gema, suplementado com vitamina C (2,5mmol/mL); grupo glutationa - sêmen diluído em Tris-gema, suplementado com glutationa reduzida (2,5mmol/mL) e grupo sêmen associado - diluído em Tris-gema, suplementado com vitamina C (1,25mmol/mL) e glutationa reduzida (1,25mmol/mL ). Posteriormente, o sêmen foi envasado em palhetas francesas e submetido à criopreservação por meio de equipamento automatizado. Após a criopreservação, o sêmen foi descongelado e avaliado quanto à motilidade espermática, à morfologia, à membrana plasmática, ao acrossoma, ao potencial mitocondrial e ao estresse oxidativo, bem como pelo teste de resistência térmica. A suplementação de extensor com a associação de vitamina C e glutationa reduzida mostrou efeitos benéficos sobre a motilidade espermática e a preservação das membranas plasmática e acrossomal durante a criopreservação de sêmen, sendo também o grupo que apresentou maiores valores de espécies reativas de oxigênio. Assim, a associação de ambos os antioxidantes contribuiu para a preservação dos espermatozóides em todas as características analisadas, sugerindo sua utilização na criopreservação de sêmen bovino.(AU)

Antioxidant effect on viability of boar semen cooled to 15°C / Influência de antioxidantes na viabilidade do sêmen suíno resfriado a 15°C

This study aimed to evaluate the addition of Vitamin C, reduced Glutathione and trolox on sperm characteristics of pork refrigerated semen. Six pigs were collected through the technique of gloved hand (10 ejaculates/animals). The semen was diluted in MR-A®. After the previous evaluations, the treatments were added: Control group: diluent only; Vitamin C Group: 200µM/mL Vitamin C; Trolox Group: 200µM/mL Trolox; Glutathione group: 2.5mM/ml Reduced glutathione. The semen was stored in thermal boxes and placed inside the refrigerator at 15oC and evaluated at D0, 12, 48, 72 hours. After 30 hours of incubation, each treatment was divided into two equal fractions and the same concentration of antioxidants was added in one of the parts. The results show that reduced glutathione supplementation preserves sperm motility after 24 hours but also has a higher percentage of acrosome intact in the presence of this antioxidant. There was no effect of adding a second dose of the antioxidants. In conclusion, the addition of reduced Glutathione to the swine semen diluent is a promising alternative for better preservation of sperm characteristics and the addition of the second dose of antioxidants during storage is detrimental to semen.(AU)

Este estudo tem como objetivo avaliar a adição da vitamina C, da glutationa reduzida e do trolox sobre características espermáticas do sêmen refrigerado de suínos. Seis cachaços foram coletados pela técnica de mão enluvada (10 coletas/animal). O sêmen foi diluído em MR-A®. Após as avaliações prévias, os tratamentos foram adicionados: grupo controle: apenas diluidor; grupo vitamina C: 200µM/mL de vitamina C; grupo trolox: 200µM/mL de trolox; grupo glutationa: 2.5mM/mL de glutationa reduzida. O sêmen foi armazenado em caixas térmicas e alocado dentro do refrigerador a 15oC e avaliado nos tempos zero, 12, 48 e 72 horas . Após 30 horas de incubação, cada tratamento foi dividido em duas frações iguais e adicionou-se a mesma concentração de antioxidantes em uma das partes. Os resultados demonstram que a suplementação de glutationa reduzida preserva a motilidade espermática após 24 horas, bem como tem maior percentual de acrossoma intacto na presença desse antioxidante. Não houve efeito ao se adicionar uma segunda dose dos antioxidantes. Em conclusão, o acréscimo da glutationa reduzida ao diluidor de sêmen suíno é uma alternativa promissora para melhor preservação das características espermáticas, e a adição da segunda dose dos antioxidantes durante o armazenamento é prejudicial ao sêmen.(AU)

Ultraestrutura e criopreservação de sêmen de jundiá amazônico (Leiarius marmoratus) em cativeiro / Ultrastructure and sperm cryopreservation of the amazon catfish (Leiarius marmoratus) in captivity

Os objetivos do presente estudo foram analisar a ultraestrutura do espermatozoide do jundiá amazônico e avaliar a sua criopreservação com três agentes crioprotetores (metanol 10%, DMSO 10% e etilenoglicol 10%) e duas soluções ativadoras (NaCl 0,29% e NaHCO3 1%). Como diluente, foi utilizada uma solução de glicose a 5%, sendo o sêmen envasado em palhetas de 0,25mL e congelado em vapor de nitrogênio (botijão dry shipper). No sêmen fresco, o espermatozoide apresentou comprimento de 25,46±2,54µm, cabeça esférica (1,51±0,18µm), ausência de acrossoma, peça intermediária com formato cônico (0,93±0,17µm), ligeiramente assimétrica, com presença de vesículas, e flagelo único (21,48±2,45µm). O sêmen descongelado apresentou valores mais altos (P<0,05) para duração, vigor e taxa de motilidade espermática com os crioprotetores metanol 10% e DMSO 10%. A duração da motilidade espermática foi maior (P<0,05) com o ativador NaHCO3 1% (21-96 s). O sêmen de Leiarius marmoratus criopreservado com DMSO e metanol apresentou, respectivamente, 7,32±4,21% e 8,94±6,69% de taxa de motilidade. No entanto, os resultados não foram satisfatórios para estabelecer um protocolo para a espécie.(AU)

The aims of this study were to describe the spermatozoon ultrastructure and to evaluate the sperm cryopreservation of the amazon catfish with three cryoprotectant agents (10% methanol, 10% DMSO, and 10% ethylene glycol) and two activator agents (0.29% NaCl and 1% NaHCO3). Glucose 5% extender was used as a diluent solution and sperm loaded in 0.25 straws was frozen in nitrogen vapor (dry shipper). Fresh spermatozoon was 25.46±2.54µm long, the head was spherical (1.51±0.18µm) with no acrosome, the midpiece was cone shaped (0.93±0.17µm) with presence of vesicles, slightly asymmetric, and the flagellum was single (21.48±2.45µm). Post-thawed semen presented higher values (P< 0.05) for duration, vigor and sperm motility rate with cryoprotectants 10% methanol and 10% DMSO. The duration of sperm motility was longer (P< 0,05) when triggered in 1% NaHCO3 (96-21 s). Leiarius marmoratus semen cryopreserved with DMSO and methanol, presented respectively 7.32±4.21% and 8.94±6.69% of motility. However, the results were not satisfactory to establish a protocol for the specie.(AU)

Efeito do ácido docosa-hexaenoico e do Trolox® no diluidor de refrigeração de sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador / Effect of docosahexaenoic acid and Trolox® in extenders for cooling semen from Mangalarga Marchador stallion

Objetivou-se avaliar o efeito do ácido docosa-hexaenoico (DHA), associado ou não ao Trolox®, na refrigeração de sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador. Foram refrigerados 10 ejaculados nos diluidores: D1) BotuSêmen® (BS; controle); D2) BS + 30ngmL-1 de DHA (BS30DHA); D3) BS30DHA + 40µM de Trolox® (BS30DHA40T); D4) BS + 50ngmL-1 de DHA (BS50DHA); D5) BS50DHA + 40µM de Trolox® (BS50DHA40T). Após 48 horas de refrigeração, foram avaliados os parâmetros de movimento espermático, a integridade estrutural e funcional da membrana plasmática e a longevidade espermática. Todos os diluidores testados preservaram, de forma semelhante, a motilidade, a linearidade, a retilinearidade, a amplitude do deslocamento lateral da cabeça, a frequência do batimento flagelar cruzado, o percentual de hiperativos e a integridade estrutural e funcional da membrana espermática (P>0,05). O diluidor BS50DHA foi superior ao BS30DHA40T em preservar a VCL e a VSL e foi superior ao BS30DHA40T e ao BS50DHA40T em preservar a VAP e o índice de oscilação (P<0,05). Conclui-se que o uso do Trolox® em diluidores utilizados para refrigeração de sêmen de garanhões contendo ácido docosa-hexaenoico, nas concentrações propostas, não é indicado por alterar parâmetros de movimento espermático considerados importantes para a fertilidade.(AU)

The objective of this study was to evaluate the effect of docosahexaenoic acid (DHA), associated or not with Trolox®, in extenders for cooling semen from Mangalarga Marchador stallions. Ten ejaculates were cooled in the following diluents: D1) BotuSemen® (BS; control); D2) BS + 30ngmL-1 DHA (BS30DHA); D3) BS30DHA + 40µM Trolox® (BS30DHA40T); D4) BS + 50ngmL-1 DHA (BS50DHA); D5) BS50DHA + 40µM Trolox® (BS50DHA40T). After 48 hours of refrigeration, the sperm movement, structural and functional integrity of the plasma membrane and sperm longevity were evaluated. All extenders tested similarly preserved motility, linearity, straightness of trajectory, amplitude of lateral head displacement, beat cross frequency, hyperactive, the structural and functional integrity of the sperm membrane (P> 0.05). The BS50DHA extender was superior to BS30DHA40T in preserving VCL and VSL and was superior to BS30DHA40T and BS50DHA40T in preserving VAP and oscillation index (P< 0.05). It is concluded that the use of Trolox® in extenders for cooling stallion sperm containing docosahexaenoic acid at the proposed concentrations is not indicated because it alters sperm movement parameters considered important for fertility.(AU)

Diluente Tris suplementado com óleo de Mauritia flexuoxa sobre a qualidade do sêmen caprino após a criopreservação / Tris diluent supplemented with Mauritia flexuoxa oil on the quality of goat semen after cryopreservation

Objetivou-se verificar os efeitos, nos parâmetros espermáticos, na integridade mitocondrial, acrossomal e de membrana em células espermáticas, desencadeados pelo uso do Tris (Tris hidroximetil aminometano) suplementado com óleo de Mauritia flexuoxa como diluente para criopreservação de sêmen caprino. Quatro caprinos clinicamente saudáveis foram utilizados. Os animais eram alimentados diariamente com volumoso (Pennisetum purpureum, Schum.), concentrado (ração peletizada com teor de 20% proteína, 300 g/animal/dia) e sal mineral específico para Caprinos (Caprinofós®), à vontade. Dois ensaios foram realizados: I – Teste de toxicidade; II – Criopreservação do sêmen com concentrações ideais. No teste de toxicidade as concentrações avaliadas foram: 5%, 10%, 15% e 20% de diluente a base de óleo de Mauritia flexuoxa. Após o teste de toxicidade, foi escolhido a concentração que apresentou o melhor resultado (5%). Logo após, foram realizadas mais 32 coletas, que foram diluídas em Tris-gema-glicerol (grupo controle) ou diluente contendo óleo vegetal (Mauritia flexuoxa). As amostras foram criopreservadas com auxílio do aparelho Tk3000®. Após o período mínimo de uma semana as palhetas foram descongeladas em banho-maria a 37 °C por 30 segundos, acondicionadas em microtubos de centrifugação e homogeneizadas para a análise imediata de motilidade, vigor espermático e morfologia. Em seguida, por meio de sondas fluorescentes foram avaliadas a integridade de acrossomo, membrana plasmática (Diacetato de Carboxifluresceína e Iodeto de Propídeo) e função mitocondrial sob microscopia de epifluorescência. Quanto a motilidade e vigor, integridade mitocondrial e acrossomal, o grupo buriti foi inferior ao grupo controle. O Tris suplementado com óleo de Mauritia flexuoxa na concentração de 5% não influenciou significativamente a qualidade espermática, porém, observouse morfologia e integridade de membrana favoráveis. Dessa forma, sendo uma alternativa para substituição de diluentes a base de produtos de origem animal.

The objective was to verify the effects, sperm parameters, mitochondrial, acrosomal and membrane integrity in sperm cells, triggered by the use of Tris (Tris hydroxymethyl aminomethane) supplemented with Mauritia flexuoxa oil as a diluent for cryopreservation of goat semen. Four goats clinically healthy were used. The animals were fed daily with bulky (Pennisetum purpureum, Schum.), concentrate (pelleted feed with 20% protein content, 300 g / animal / day) and mineral salt Specific for Goats (Caprinofós®), ad libitum. Two tests were carried out: I - Toxicity test; II - Semen cryopreservation with ideal concentrations. In the toxicity test as selected were: 5%, 10%, 15% and 20% of Mauritia flexuoxa oil-based diluent. After the toxicity test, the concentration that showed the best result (5%) was chosen. Soon after, a further 32 samples were obtained, which were diluted in Tris-glycerol (control group) or diluent containing vegetable oil (Mauritia flexuoxa). The samples were cryopreserved using the Tk3000® machine. After a minimum of one week, the samples were thawed in a 37 ° C water bath for 30 seconds, packed in centrifugation microtubes and homogenized for immediate analysis of motility, sperm vigor and morphology. Then, by means of fluorescent probes, the integrity of the acrosome, plasma membrane (Carboxyflurescein diacetate and Propidium Iodide) and mitochondrial function under epifluorescence microscopy were evaluated. As for motility and vigor, mitochondrial and acrosomal integrity, the buriti group was inferior to the control group. Tris supplemented with Mauritia flexuoxa oil at a concentration of 5% did not significantly influence sperm quality, however, favorable motility, morphology and membrane integrity were observed. Thus, being an alternative to replace diluents based on products of animal origin.

Utilização da lipoproteína de baixa densidade, em diferentes concentrações, em meio diluidor para criopreservação do sêmen ovino / Use of low density lipoprotein in different concentrations in diluent medium for cryopreservation of ovine semen

A utilização da gema de ovo dificulta a padronização de meios diluidores e apresenta riscos biológicos. Assim, este estudo avaliou diferentes concentrações da lipoproteína de baixa densidade (LDL), em substituição à gema de ovo, para a confecção de diluentes para criopreservação espermática em ovinos. Foram utilizados um diluidor controle (CTR= 20% de gema de ovo) e cinco tratamentos, substituindo-se a gema pelas diferentes proporções de LDL (T1=6%; T2=8%; T3=12%; T4=16%; T5=20%), todos à base de TRIS-glicerol. Para o estudo, utilizaram-se dois ejaculados, de seis reprodutores da raça Santa Inês. Sessenta dias após a criopreservação, as amostras foram descongeladas e avaliadas subjetivamente quanto à motilidade total (MT, %) e progressiva (MP, %), ao vigor (1-5) e à integridade funcional (choque hisposmótico com água destilada, %) e estrutural (corante supravital eosina, %) das membranas espermáticas. As avaliações de vigor e funcionalidade de membrana não diferiram (P>0,05) entre os grupos. Entretanto, os grupos T4 (P<0,01) e T5 (P<0,05) foram superiores ao CTR para os parâmetros MT, MP e integridade estrutural de membrana, o que confirma que as LDLs podem ser alternativas eficientes para substituição da gema de ovo em diluidores para criopreservação de sêmen ovino.(AU)

The use of egg yolk makes it difficult to standardize extenders and presents biological hazards. Thus, this study evaluated different concentrations of low-density lipoprotein (LDL) to replace yolk extenders for production of sperm for cryopreservation in ovine. A control extender was used (CTR= 20% yolk) and five treatments, replacing the yolk by different ratios of LDL (T1= 6%; T2= 8%, T3= 12%; T4= 16%; T5= 20%) all based on TRIS-glycerol. For the study, two ejaculates from six Santa Ines breeding were used. Sixty days after cryopreservation, the samples were thawed and evaluated for total motility (MT, %) and progressive motility (MP, %), vigor (1-5) and the functional integrity (hyposmotic shock with distilled water, %) and structural (supravital dye eosin, %) of the sperm membranes. The evaluations of strength and membrane functionality didn't differ (P> 0.05) between groups. However, T4 (P< 0.01) and T5 (P< 0.05) groups were superior to the CTR for the MT, MP, and membrane structural integrity parameters, which confirms that LDLs can be efficient alternatives for yolk replacement in extenders for cryopreservation of ovine semen.(AU)

Use of the ACP® and BTS extenders for cooling at 15°C white-lipped peccary (Tayassu pecari) semen / Uso dos diluidores ACP® e BTS para refrigeração a 15°C de sêmen de queixada (Tayassu pecari)

Knowledge about reproduction of white-lipped peccary is of great importance to assist with the conservation of this species and enable its rational use in captivity. This study aimed to evaluate the effect of ACP-103®, ACP-116® and BTS semen extenders on sperm viability during cooling of Tayassu pecari semen. Five ejaculates from four adult males were chilled. The animals were submitted to the protocols of sedation and anesthesia for semen collection by the electroejaculation method. After collection, the semen was macro- and microscopically assessed and diluted to reach 35x106 spermatozoa/mL in each of the three different extenders tested. The fresh-extended semen was packed in a BotuFLEX® thermal box to keep samples at 15°C for 24 hours. After cooling, the following semen parameters were analyzed: sperm motility, functional and structural integrity of sperm membranes, mitochondrial activity, chromatin condensation, and the thermoresistance test was performed. The parameters sperm motility, structural and functional integrity of sperm membranes, mitochondrial activity, and chromatin condensation were preserved after use of the extenders tested, and were similar to those of in natura semen (p>0.05). Curvilinear velocity (VCL) (p<0.05) was the only parameter with reduced values after cooling regardless of the extender used. The percentage of sperm with normal morphology was greater in samples cooled using the BTS extender (p<0.05). The ACP-103®, ACP-116® and BTS extenders can be used for the cooling and preservation of white-lipped peccary semen at 15°C for 24 hours.(AU)

Para auxiliar na conservação da espécie e permitir o uso racional do queixada em cativeiro é de grande importância o conhecimento sobre a reprodução da espécie. Objetivou-se avaliar o efeito dos diluidores de sêmen ACP-103®, ACP-116® e BTS na viabilidade espermática durante a refrigeração do sêmen do Tayassu pecari. Foram refrigerados cinco ejaculados provenientes de quatro machos adultos. Os animais foram contidos com auxílio de puçá e submetidos ao protocolo de sedação e anestesia para realização da coleta de sêmen pelo método da eletroejaculação. Depois da coleta, o sêmen foi avaliado macro e microscopicamente e diluído para atingir 35x106 espermatozoides/mL em cada um dos três diferentes diluidores testados. O sêmen diluído foi acondicionado em caixa térmica BotuFLEX® para manter as amostras a 15°C por um período de 24 horas. Depois da refrigeração, os espermatozoides foram avaliados quanto aos parâmetros de movimento espermático, integridade funcional e estrutural das membranas espermáticas, atividade mitocondrial, condensação da cromatina e teste de termorresistência. Os diluidores testados preservaram as características cinéticas, a integridade estrutural e funcional das membranas espermáticas, a atividade mitocondrial e a condensação da cromatina semelhante ao sêmen in natura (P>0,05). O único parâmetro que reduziu com o processo de refrigeração independente do diluidor utilizado foi a Velocidade Curvilinear (VCL) (P<0,05). Foi observado aumento do percentual de espermatozoides morfologicamente normais nas amostras refrigeradas em BTS (P<0,05). Os diluidores ACP-103®, ACP-116® e BTS podem refrigerar e conservar o sêmen de queixada a 15°C por 24 horas.(AU)

Addition of chlorogenic acid and caffeine during the processing of cooled boar semen / Adição de ácido clorogênico e cafeína durante o processamento do sêmen suíno resfriado

A study was conducted to evaluate the effect of chlorogenic acid (ChA) added pre-cooling and its combination with caffeine added during warming on cooled-stored boar semen parameters. Ten ejaculates were diluted in commercial extender with or without 4.5mg/ml ChA and stored at 15°C. After 0, 24 and 72 hours of storage, aliquots of these doses were taken and incubated at 37°C in the presence or absence of 8.0mM caffeine. Semen quality was evaluated after 10 and 120 minutes of incubation. The ChA increased (P <0.01) the sperm motility, viability, acrosomal integrity and the percentage of spermatozoa with high mitochondrial activity (PMHA), however, decreased (P <0.01) the malondialdehyde (MDA) concentration. Caffeine increased (P<0.05) the sperm motility, viability, PMHA and the MDA concentration and reduced (P <0.05) the acrosome integrity. When associated (ChA+caffeine), there was an increase (P <0.05) in sperm motility and viability, PMHA and acrosome integrity. The addition of ChA to the dilution medium improves the quality of the swine inseminating doses. The addition of caffeine during re-warming is only recommended when the semen is stored for prolonged periods (72h), and the inseminating dose should be used immediately after its addition.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da adição de ácido clorogênico (ChA) antes do resfriamento e sua combinação com cafeína adicionada durante o reaquecimento sobre a qualidade do sêmen suíno resfriado. Dez ejaculados foram diluídos em diluidor comercial com adição ou não de 4,5mg/mL de ChA e armazenados a 15°C. Após zero, 24 e 72 horas de armazenamento, 10mL foram retirados e incubados a 37°C na presença ou ausência de 8,0mM de cafeína. A qualidade seminal foi avaliada após 10 e 120 minutos de incubação. O ChA aumentou (P<0,01) a motilidade, a viabilidade, a integridade acrosomal e a porcentagem de espermatozoides com alta atividade mitocondrial (PMHA), entretanto diminuiu (P<0,01) a concentração de malondialdeído (MDA). A cafeína aumentou (P<0,05) a motilidade, a viabilidade, a PMHA e a concentração de MDA e reduziu a integridade acrossomal. Quando associados (ChA+cafeína), houve aumento (P<0,05) na motilidade, na PMHA, na viabilidade e na integridade acrossomal. Conclui-se que a adição de ChA ao meio de diluição melhora a qualidade das doses inseminantes de suínos. A adição de cafeína durante o reaquecimento só é recomendada ao sêmen adicionado de ChA quando esse for armazenado por períodos prolongados (72h), devendo a dose inseminante ser utilizada imediatamente após sua adição.(AU)

Mini-percoll gradient may be used for frozen-thawed sperm selection in sheep / Gradiente de mini-Percoll pode ser utilizado na seleção espermática de sêmen congelado de ovinos

This study evaluated the effect of increasing centrifugal force and reducing centrifugation time and volume in Percoll protocols on ram sperm parameters. Commercial semen of Santa Inês rams were used and five treatments were performed: traditional Percoll and mini-Percoll (MP) techniques (I- 5000 x g, 5min; II- 2500 x g, 5min; III- 1250 x g, 5min; IV- 700 x g, 10min). At post-thawing (PT) and post-selection protocols (0h), samples were assessed for spermatozoa recovery rate, motility, plasma membrane (PM) integrity, sperm capacitation and morphology and incubated at 37 C for 1, 2 and 3h. The sperm recovery rate averaged 9.1±1.4%, and most motility parameters were similar (P> 0.05) among protocols. VCL (µm/s) was higher (P< 0.05) after MP-II, III and IV (66.1±4.5) than traditional Percoll (46.3±4.9). Capacitation status and PM integrity were similar (P> 0.05) among treatments. For the first time, we have demonstrated the reduction of the gradient volume and centrifugation time associated with an increase on centrifugation force at Percoll can be successfully used for frozen-thawed ram sperm selection. MP may be used instead of traditional Percoll, decreasing costs and semen handling time.(AU)

O presente estudo avaliou o efeito do aumento da força de centrifugação, bem como da redução do tempo de centrifugação e do volume do gradiente de Percoll em diferentes protocolos nos parâmetros espermáticos de ovinos. Foi utilizado sêmen comercial de carneiros da raça Santa Inês, e cinco tratamentos foram realizados: Percoll tradicional e quatro técnicas de mini-Percoll (I- 5000 x g, 5min; II- 2500 x g, 5min; III- 1250 x g, 5min; IV- 700 x g, 10min). Após o descongelamento e a seleção espermática em cada técnica utilizada (0h), amostras foram avaliadas quanto à taxa de recuperação espermática, motilidade, integridade de membrana plasmática, capacitação e morfologia. Ao final, foram incubadas a 37 ºC por uma, duas e três horas. A taxa de recuperação média (9,1±1,4%) e a maioria dos parâmetros de motilidade foram similares (P>0,05) entre os tratamentos. VCL foi maior (P<0,05) após MP-II, III e IV (66,1±4,5) quando comparados ao Percoll tradicional (46,3±4,9). O status da capacitação e a integridade de membrana foram similares (P>0,05) entre os tratamentos. Pela primeira vez, foi demonstrado que a redução do volume do gradiente utilizado e do tempo de centrifugação, associada com o aumento da força de centrifugação nos protocolos de Percoll, pode ser usada com sucesso na seleção espermática de sêmen congelado de ovinos. O mini-Percoll pode ser utilizado em alternativa à técnica de Percoll tradicional, diminuindo custos e tempo de manipulação do sêmen durante a técnica.(AU)

(+)-Catechin and (-)-epigallocatechin gallate: are these promising antioxidant therapies for frozen goat semen? / (+)-Catequina e (-)-epigalocatequina galato: essas são promissoras terapias antioxidantes para a congelação de sêmen caprino?

The aim of this study was to evaluate the effects of different concentrations of (+)-catechin or (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) on goat semen freezability. Poolsof semen were processed (Experiment 1: 0, 15, 25, 50, 75, or 100µM (+)-catechin; Experiment 2: 0, 15, 25, 50, 75, or 100µM EGCG) and frozen. After thawing, the samples were evaluated for kinematics, plasma membrane (PMi) and acrosome integrity, morphology, and oxidative stress, at 0 and 1h. In Experiment 1, at 0h, VSL and VAP were greater (P<0.05) with 15µM than with 50 and 100; WOB was lower (P<0.05) with 100µM than with 0, 15, and 25; and BCF was higher (P<0.05) with 75 and 100µM than with 0. In turn, in Experiment 2, progressive motility was higher (P<0.05) with0 and 15µM than with50 and 75; LIN was lower (P<0.05) with75 and100µM than with0 and 15; WOB was higher (P<0.05) with0 and 15µM; and PMi was greater (P<0.05) with100µM than 0. Thus, (+)-catechin or EGCG at higher concentrations inhibits the kinematics of frozen goat sperm, in a transitory way, and 100µM of EGCG preserves the PMi.(AU)

Objetivou-se avaliar o efeito de diferentes concentrações de (+)-catequina ou (-)-epigalocatequina galato (EGCG) sobre a congelabilidade do sêmen caprino. Poolsseminais foram processados (experimento 1: 0, 15, 25, 50, 75 ou 100µM de (+)-catequina; experimento 2: 0, 15, 25, 50, 75 ou 100µM de EGCG) e congelados. Após a descongelação, foram avaliadas a cinética, a integridade de membrana plasmática (iMP) e acrossomal, a morfologia e o estresse oxidativo, a zero e a uma hora. No experimento 1, a zero hora, VSL e VAP foram maiores (P<0,05) com 15µM do que com 50 e100; WOB foi menor (P<0,05) com 100µM do que com 0, 15 e 25; e BCF foi maior (P<0,05) com 75 e 100µM do que com 0. No experimento 2, a motilidade progressiva foi maior (P<0,05) com 0 e 15µM do que com 50 e 75; LIN foi menor (P<0,05) com 75 e 100µM do que com 0 e 15; WOB foi maior (P<0,05) com 0 e 15µM; e iMP foi maior (P<0,05) com 100µM do que com 0. Assim, (+)-catequina ou EGCG em altas concentrações inibem, transitoriamente, a cinética de espermatozoides congelados caprinos, e 100µM de EGCG preserva a iMP.(AU)

Diferentes protocolos de congelação de sêmen canino para melhoria de sua cinética e viabilidade / Different canine semen freesing protocols to improve kinetics and viability / Diferentes protocolos de congelación de semen canino para mejoría de su cinética y viabilidad

A maioria dos protocolos utilizados para a criopreservação de sêmen canino, se baseiam em metodologias descritas para outras espécies. Assim, este estudo tem como objetivo avaliar diferentes protocolos de congelação para sêmen desta espécie doméstica. Para tanto, foram utilizados 3 machos, adultos, da raça Buldogue Campeiro, com idades entre 2 a 5 anos e fertilidade comprovada. Foram realizadas 5 colheitas de sêmen de cada animal, pelo método de manipulação digital do bulbo peniano, priorizando a segunda fração do ejaculado. As amostras colhidas foram divididas em 2 grupos, com concentração de 100 x 106 espermatozoides por mL. No grupo 1, as amostras foram diluídas diretamente em meio de congelação comercial Botudog® (Botupharma Biotecnologia Animal). No grupo 2, as amostras foram centrifugadas a 600 g por 10 minutos e em seguida, o pellet foi ressuspendido em meio de congelação comercial Botudog®. As amostras foram envasadas em palhetas de 0,5 mL com concentração de 50 x 106 espermatozoides viáveis. Em seguida, as amostras permaneceram por 1 hora em estabilização a 5ºC. Logo após, transferidas para o vapor de nitrogênio durante 10 minutos, e por fim, mergulhadas em nitrogênio e armazenadas em botijão criogênico. As palhetas foram descongeladas a 46ºC por 15 segundos. Foram avaliados os parâmetros de cinética espermática e integridade de membrana plasmática e acrossomal (IMPA, %). Verificou-se que os parâmetros de motilidade total (%), velocidade linear progressiva (VSL; µm/s), velocidade curvilínea (VCL; µm/s), linearidade (%), percentagem de espermatozoides rápidos (%) e integridade de membrana plasmática e acrossomal avaliados por citometria de fluxo foram superiores no grupo 1, em que as amostras não foram centrifugadas. Estes dados demonstram que, o protocolo para congelação de sêmen canino, utilizando o diluente Botudog®, não preconiza a centrifugação do ejaculado, previamente a congelação.(AU)

Most protocols used for canine semen cryopreservation are based on methodologies described for other species. Thus, this study aims at evaluating different freezing protocols for semen of this domestic species. To this end, 3 adult Bulldog Campeiro males aged 2 to 5 years and proven fertility were used. Five semen samples were collected from each animal using the digital manipulation of the penile bulb method, prioritizing the second fraction of the ejaculate. The collected samples were divided into 2 groups, with a concentration of 100 x 106 sperm per mL. In group 1, the samples were diluted directly into Botudog® commercial freezing medium (Botupharma Animal Biotechnology). In group 2, the samples were centrifuged at 600 g for 10 minutes and then the pellet was resuspended in commercial Botudog® freezing medium. The samples were packed in 0.5 mL straws with a concentration of 50 x 106 viable sperm. Then, the samples remained for 1 hour in stabilization at 5ºC. Afterwards, they were transferred to nitrogen vapor for 10 minutes, and finally, dipped in nitrogen and stored in cryogenic cylinder. The straws were thawed at 46ºC for 15 seconds. Parameters for spermatic kinetics, and plasma and acrosomal membrane integrity (IMPA, %) were evaluated. Total motility (%), progressive linear velocity (VSL; µm/s), curvilinear velocity (VCL; µm/s), linearity (%), percentage of rapid sperm (%) and membrane integrity were found. Plasma and acrosomal samples evaluated by flow cytometry were higher in group 1, where samples were not centrifuged. These data demonstrate that the protocol for canine semen freezing using Botudog® diluent does not recommend centrifugation of the ejaculate prior to freezing.(AU)

La mayoría de los protocolos utilizados para la criopreservación de semen canino se basan en metodologías descritas para otras especies. Por lo tanto, esta investigación tiene como objetivo evaluar diferentes protocolos de congelación para el semen de esta especie doméstica. Con este fin, se utilizaron 3 machos, adultos, de la raza Bulldog Campero, con edades entre 2 a 5 años y fertilidad comprobada. Se realizaron cinco recolecciones de semen de cada animal mediante el método de manipulación digital del bulbo del pene, priorizando la segunda fracción de la eyaculación. Las muestras recolectadas se dividieron en 2 grupos, con una concentración de 100 x 106 espermatozoides por mL. En el grupo 1, las muestras se diluyeron directamente en medio de congelación comercial Botudog® (Botupharma Animal Biotechnology). En el grupo 2, las muestras fueron centrifugadas a 600 g durante 10 minutos y luego el pellet fue resuspendido en medio de congelación comercial Botudog®. Las muestras se envasaron en paletas de 0,5 mL con una concentración de 50 x 106 espermatozoides viables. Luego, las muestras permanecieron durante 1 hora en estabilización a 5ºC. Posteriormente, se transfirieron al vapor de nitrógeno durante 10 minutos y, finalmente, se sumergieron en nitrógeno y se almacenaron en un cilindro criogénico. Las paletas se descongelaron a 46ºC durante 15 segundos. Se han evaluado los parámetros de la cinética espermática y la integridad de la membrana plasmática acrosomal (IMPA, %). Se verificó que los parámetros de motilidad total (%), velocidad lineal progresiva (VSL; µm/s), velocidad curvilínea (VCL; µm/s), linealidad (%), porcentaje de espermatozoides rápidos (%) e integridad de la membrana plasmática y acrosomal evaluadas por citometría de flujo, fueron mayores en el grupo 1, donde las muestras no fueron centrifugadas. Estos datos demuestran que, el protocolo para la congelación de semen canino, usando el diluyente Botudog®, no preconiza la centrifugación del eyaculado, previamente a la congelación.(AU)