ABSTRACT
The venom phosphodiesterase I (PDE-I, EC 3.1.4.1) is useful in the elucidation of the structure and nucleotide sequence of nucleic acids. In the present study, PDE-I was purified from Agistrodon bilineatus venom by preparative native-PAGE. A single protein band was observed in analytical native-PAGE. The enzyme also gave a single band in SDS-PAGE with a molecular mass of 140 kDa. The position of the band was not altered in the presence of β-mercaptoethanol, suggesting the protein did not contain subunits. The enzyme was free from 5’-nucleotidase and alkaline phosphatase activities. It showed a broad optimum pH range (9.0-11.0), whereas the optimum temperature was found to be 600C, with activity decreasing at >650C. Energy of activation (Ea) was calculated to be 0.31. The PDE-I was a glycoprotein having 14% of carbohydrate content. The Vmax, Km, Kcat and Ksp values of the enzyme were 3.85 μM/min/mg, 8.3 × 10-3 M, 23s-1 and 46.4 M-1 Min-1 respectively. Cysteine caused a non-competitive inhibition with a Ki 6.3 × 10−3 M (IC50 of 1.6 mM), whereas ADP caused a competitive inhibition having Ki 0.8 × 10−3 M (IC50 5.4 mM). Glutathione, o-phenanthroline, zinc and EDTA inhibited the enzyme activity, whereas Mg2+ slightly potentiated the activity. The enzyme hydrolyzed thymidine 5’-monophosphate p-nitro-phenyl ester most readily (10-fold), while 3’-5’-cAMP was least readily hydrolyzed substrate. The enzyme up to 4.0 mg/Kg i.p was not lethal in mice. It exhibited an anticoagulant effect, and increased the normal clotting time of normal citrated human plasma, whereas the crude venom showed strong coagulant effect. The above results showed that the A. bilineatus PDE-I was very similar to that isolated from other snake venoms. The purification procedure described here is simple, rapid and reproducible and may prove useful to isolate pure protein for investigation into the contribution of this enzyme to the biological activities of A. bilineatus venom and PDE-I insight, in general.
Subject(s)
Crotalid Venoms/analysis , Crotalid Venoms/chemistry , Crotalid Venoms/enzymology , Phosphodiesterase I/analysis , Phosphodiesterase I/chemistry , Phosphodiesterase I/enzymology , Snakes , Venoms/analysis , Venoms/chemistry , Venoms/enzymologyABSTRACT
Se estudió el efecto del veneno con desencadenante de mediadores de respuesta sistémica. Para ello se utilizó un test de ELISA desarrollado en el Instituto de Investigaciones Científicas que permitió discernir en la emergencia cuales pacientes recibieron veneno y racionalizar el uso del antiveneno en el momento de la admisión del paciente. El objetivo de este trabajo es correlacionar los grados de intensidad clínica con las concentraciones del veneno, cifras de amilasa, glicemia, y la interleuquina 1 (IL-1 alfa), interleuquina 6 (IL-6), factor de necrosis tumoral a (TNF alfa), óxido nítrico (NO). Se determinaron estos valores en 96 pacientes pediátricos que acudieron a la emergencia del Hospital Victorino Santaella de Los Teques con emponzoñamiento escorpiónico por T. discrepans, entre mayo de 2001 y mayo de 2002 utilizando criterios de inclusión, clasificado el emponzoñamiento y la terapia específica de acuerdo a las pautas del Hospital Victorino Santaella de Los Teques. Obteniendo resultados expresados en medianas y sus intervalos de confianza al 95 por ciento, que reflejaron una correlación entre la concentración de veneno en plasma y la gravedad del escorpionismo. Las citoquinas estudiadas revelaron un estudio similar con predominio de la interleuquina 6 y el óxido nítrico. Nuestros resultados demuestran que el veneno del escorpión es capaz de producir un cuadro de respuesta inflamatoria sistémica, de allí la iportancia de colocar la antivenina precozmente sin esperar el efecto desencadenante de los mediadores de la cascada inflamatoria cuyo proceso es difícil detener y sus consecuencias pueden incidir en un mayor deterioro del paciente