Equine yolk sac: a stem cells source / Saco vitelino equino: una fuente de células madre

SUMMARY: Mesenchymal stem cells are characterized by in vitro high proliferation and multilineage potential maintenance. This study aimed to isolate and characterize equine YS mesenchymal stem cells and compare these with amniotic membranes. The yolk sac (YS) and amniotic membranes (AM) were obtained from 20 pregnant mares with gestational age around 30 days. Cells were cultured in α-MEM supplemented with 15 % FBS, 1 % antibiotic solution, 1 % L-glutamine and 1 % nonessential amino acids. To cell characterization we used cytogenetic analysis, fibroblast colony-forming unit assays, cell growth curves, immunophenotyping, flow cytometry, differentiation assays and teratoma formation. Results: Both cell sources presented fibroblastoid and epithelioid-like format. The YS cells have lower colony formation potential then AM ones, 3 versus 8 colonies per 103 plated cells. However, YS cells grew progressively while AM cells showed steady. Both, the YS and amnion cells immunolabeled for Oct-4, Nanog, SSEA-3, cytokeratin 18, PCNA, and vimentin. In addition, presented mesenchymal, hematopoietic, endothelial and pluripotency markers in flow cytometry. Discussion: Both cell sources presented high plasticity and differed into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages, and no tumor formation in nude mice was observed. The results suggest that horse YS may be useful for cell therapy such as amnion-derived cells.

RESUMEN: Las células madre mesenquimales se caracterizan por una alta proliferación in vitro y un mantenimiento potencial de múltiples líneas. Este estudio tuvo como objetivo aislar y caracterizar las células madre mesenquimales del saco vitelino equinas y compararlas con las membranas amnióticas. Se obtuvo el saco vitelino (SV) y las membranas amnióticas (MA) de 20 yeguas preñadas con edad gestacional de aproximadamente 30 días. Las células se cultivaron en α -MEM suplementado con 15 % de FBS, 1 % de solución antibiótica, 1 % de L-glutamina y 1 % de aminoácidos no esenciales. Para la caracterización celular utilizamos análisis citogenéticos, ensayos de unidades de colonias de fibroblastos, curvas de crecimiento celular, inmunofenotipaje, citometría de flujo, ensayos de diferenciación y formación de teratomas. Ambas fuentes celulares presentaron formato fibroblastoideo y epitelioide. Las células SV tienen un potencial de formación de colonias más bajo que las de MA, 3 versus 8 colonias por 103 células en placa. Sin embargo, las células SV crecieron progresivamente mientras que las células MA se mostraron estables. Tanto las células YS como las células amnios están inmunomarcadas para Oct-4, Nanog, SSEA-3, citoqueratina 18, PCNA y vimentina. Además, presentó marcadores mesenquimales, hematopoyéticos, endoteliales y pluripotenciales en citometría de flujo. Ambas fuentes celulares presentaron alta plasticidad y diferían en linajes osteogénicos, adipogénicos y condrogénicos, y no se observó formación de tumores en ratones. Los resultados sugieren que el SV de caballo puede ser útil para la terapia celular, como las células derivadas de amnios.

Ontogenia do sistema hematopoético em embriões de Gallus gallus domesticus L. a expansão da hematopoese no saco vitelínico e sua migração para o fígado e para a medula óssea / Ontogeny of the hematopoietic system in embryos of Gallus gallus domesticus L. the expansion of hematopoiesis in the yolk sac and their migration to the liver and bone marrow

O presente trabalho objetivou estudar aspectos morfológicos e funcionais do sistema hematopoético em diferentes fases do desenvolvimento embrionário de Gallus gallus domesticus L. Ovos embrionados foram incubados entre 26 horas a 21 dias de desenvolvimento (dd). Embriões e seus anexos foram coletados diariamente e blocos histológicos foram produzidos. Seções de cada bloco foram coradas pelas técnicas HE, Giemsa de Lennert, Sirius Red pH 10,2 e PAS, analisando-se o saco vitelínico, fígado e medula óssea. O saco vitelínico foi o único sítio hematopoético dentre 13 e 14dd. Dos 14 aos 20dd, a hematopoese ocorreu no saco vitelínico e na medula óssea. O fígado mostrou diferenciação granulocítica no conjuntivo dos espaços portais a partir dos 15dd. As linhagens eritrocítica e granulocítica se expandiram no saco vitelínico, respectivamente de 6 a 19dd e de 7 a 20dd. Na medula óssea, os granulócitos foram observados aos 10dd, seguindo o estabelecimento da granulopoese no estroma aos 14dd e da eritropoese nos sinusóides aos 15dd. Aspectos topográficos e morfológicos de sacos vitelínicos foram detalhados, associando macroscopia à microscopia. Membranas vitelínicas de 12 e 14dd foram analisadas macroscopicamente, regionalizadas em áreas, observadas ao microscópico estereoscópico e processadas. Os cortes foram corados em HE e escaneados em digitalizador de lâminas. Macroscopicamente, as membranas vitelínicas possuem três áreas concêntricas. A microscopia estereoscópica demonstrou uma cobertura translúcida nas veias vitelínicas e que varia de translúcida a opaca nas artérias. Em ambos os vasos, essa cobertura é o endoderma. Eritropoese e granulopoese ocorreram nas adjacências das artérias e nas três regiões. Em membranas vitelínicas de diferentes estádios, as colorações PAS, PAS-AB (pH 2,5 e 1,0), picrosirius, resorcina fucsina de Weigert e reticulina de Gomori foram realizadas, além de imunohistologia para diferentes anticorpos. Observou-se positividade para alfa-actina de músculo liso na vasculatura vitelínica e expressão para a fibronectina no entorno dos vasos e na matriz extracelular durante o desenvolvimento. Análises tomográficas à microscópia confocal de membranas vitelínicas coradas com berberina e laranja de acridina demonstraram a presença de ramos arteriais. Focos de granulopoese se dispuseram numa matriz constituída por glicoproteínas, glicosaminoglicanos, fibras reticulares e fibronectina. A eritropoese ocorre nos ramos arteriais, delimitados pelas moléculas supracitadas, fibras colágenas e elásticas. A concentração e localização das fibras reticulares variaram de acordo com o desenvolvimento, sendo presentes entre artérias, seus ramos e endoderma; entre endoderma e veias. Células endodérmicas, eritroblastos e granulócítos em diferenciação expressaram VEGF. Eritroblastos foram VEGF-C positivos e a expressão de VEGFR-3 mostrou-se presente em vasos de pequeno calibre. Em conclusão, o presente estudo sugere que: 1- o saco vitelínico é o principal sítio de expansão no Gallus gallus sp.; 2- a hematopoese hepática é restrita à granulopoese, aos espaços porta e quando a medula óssea é funcional; 3- a eritropoese no saco vitelínico e medula óssea do Gallus gallus sp. está associada ao endotélio e à granulopoese, ao estroma; 4- as fibras reticulares no saco vitelínico desempenham funções de sustentação, na granulopoese e participam da morfogênese deste anexo; 5- células endodérmicas e hematopoéticas modulam a angiogênese no saco vitelínico.

Ultrastructural observations of the vitelline cells of Metamicrocotyla macracantha (Monogenea, Microcotylidae)

An electron microscopic study of the vitelline follicles of Metamicrocotyla macracantha (Alexander, 1954) Karatha, 1955 showed that they are composed of cells in different stages of development. The immature cells have a large nucleus, nucleolus, cytoplasm with free ribosomes and few mitochondria. The development vitelline cells present granules which are small in the early stages, increasing with maturity. The mature cells have an extensive granular endoplasmic reticulum and droplets of shell-protein; with maturation, clusters of shell protein and yolk bodies are formed and released in the ciliated vitelline ducts. Vitelline development is continuous and all of the cellular stages involved can be found in each follicle.

Haemopoietic stem cells during development of mouse embryo.

Haemopoiesis in mammals takes place in yolk-sac and in mouse it can be detected on the 7th day of gestation. Erythropoietin (EPO) responsive cells can be detected from 7th day onwards. However, the cells committed to the myeloid lineage which can respond to the haemopoietic growth factor (viz. granulocyte macrophage colony stimulating factor; GM-CSF) can be demonstrated only on 10th day of gestation. At the same time, the 12-day spleen colony forming cells i.e. the late colony forming unit spleen (CFU-s) which are multipotent stem cells can also be detected. Data suggest that the stem cells seen in the embryo from 7-10 days of gestation may be a primitive population confined only to the yolk-sac. Liver haemopoiesis which begins in the liver of 13-day embryos is due to primitive haemopoietic pluripotent stem cells, arising de novo in the embryo and not in the yolk-sac, since no primitive pluripotent stem cells capable of repopulating lethally irradiated bone-marrow can be detected in the yolk-sac.