Anticuerpos de cadena única de alpaca para la detección de antígenos de Fasciola hepática / Single-chain antibodies from alpaca for the detection of Fasciola hepatica antigens

RESUMEN Objetivo. Producir anticuerpos recombinantes de cadena única de alpaca que se unan con alta afinidad y especificidad al antígeno excretado-secretado (ES) de Fasciola hepatica para el desarrollo de tecnologías nuevas de diagnóstico de fascioliasis humana y animal. Materiales y métodos. Se ha construido una genoteca de cADNde los dominios variables de anticuerpos de cadena única pesada, conocidos como VHH, a partir de células mononucleares de sangre periférica de una alpaca inmunizada con el antígeno ES de F. hepatica. La genoteca fue tamizada con el antígeno ES por despliegue diferencial de fagos (phage display), seleccionando diez VHH que se unen específicamente a ES. El VHH anti ES fue clonado en un vector de expresión, la proteína recombinante (VHH-ES1) de 15,3 kDa fue producida por fermentación en E. coli y purificada a homogeneidad por cromatografía de afinidad. La unión del VHH-ES1 al antígeno ES fue evaluada por ELISA usando VHH-ES1 como anticuerpo de captura, antisuero policlonal anti-ES de conejo y conjugado anti IgG de conejo con peróxidasa de rábano. Resultados. Se ha identificado y producido un VHH-ES1 recombinante que se une al antígeno ES (VHH-ES1) que correspondía a un anticuerpo de la subclase IgG2 de bisagra larga. La unión del anticuerpo VHH-ES1 al antígeno muestra linealidad respecto a la concentración de ES en el rango de 50-5000 ng/mL y el valor límite de detección del antígeno está en el rango de 30-170 ng/mL de ES (R2=0,99). Conclusión . El VHH-ES1 se une con afinidad y especificidad al antígeno ES de F. hepatica y es un anticuerpo promisorio a evaluar para el desarrollo de nuevas tecnologías de diagnóstico de fascioliasis.

ABSTRACT Objectives. To produce recombinant single-chain antibodies from alpaca that will bind to the excreted-secreted (ES) Fasciola hepatica antigen with high affinity and specificity, so as to develop new diagnostic technologies of human and animal fascioliasis. Materials and Methods. A gene bank of DNA of the variable dominions of heavy single-chain antibodies (VHH) has been created, based on mononuclear cells of peripheral blood of an alpaca immunized with the ES antigen of F. hepatica. The gene bank was screened with the ES antigen by differential phage display, selecting ten VHH that bind specifically to ES. The anti-ES VHH was cloned in an expression vector, the recombinant protein (VHH-ES1) of 15.3 kDa was produced by fermentation in E. coli and purified to homogeneity by affinity chromatography. The binding of VHH-ES1 to the ES antigen was evaluated by ELISA using VHH-ES1 as capture antibody, policlonal anti-ES serum of rabbit and conjugated rabbit anti IgG with radish peroxidase. Results. A VHH that binds to the ES antigen (VHH-ES1) has been identified through differential phage display and produced by fermentation in E. coli; this corresponds to an antibody of the long-hinge IgG2 subclass. The binding of the VHH-ES1 antibody to the antigen shows linearity with respect to the concentration of ES in the 50-5,000 ng/mL range and the limit of detection value of the antigen is in the 30-170 ng/mL range of ES (R2=0.99). Conclusions. The VHH-ES1 binds with affinity and specificity to the ES antigen of F. hepatica and is a promissory antibody to be assessed for the development of new fascioliasis diagnostic technologies.

Efecto in vitro del antirretroviral tipranavir sobre taquizoitos de Toxoplasma gondii

La introducción de la terapia antirretroviral de alta eficiencia ha conllevado a una disminución en la frecuencia de neurotoxoplasmosis en personas con VIH. Experimentalmente se demostró que los antirretrovirales inhibidores de proteasas pueden tener además una acción directa sobre el parásito, en este caso Toxoplasma gondii. El objetivo es evaluar la actividad antitoxoplasma in vitro del tipranavir, un antirretroviral inhibidor de proteasa de tercera generación. Para ello se determinó la inhibición del crecimiento causada por el tipranavir sobre taquizoitos intracelulares de Toxoplasma gondii, así como su citotoxicidad frente a macrófagos residentes en el peritoneo de ratones OF-1. En paralelo, se evaluaron el atazanavir, la sulfadiazina y pirimetamina como fármacos de referencia. El tipranavir mostró actividad inhibitoria frente a taquizoitos de T. gonddi, con una CI50 de 21,2 ± 3,0 µM, la cual fue similar (p> 0,05) a la obtenida con la sulfadiazina (CI50= 23,3 ± 3,6 µM) y mayor (p< 0,05) que el atazanavir (CI50= 2,8 ± 0,7 µM) y la pirimetamina (CI50= 1,2 ± 0,2 µM). Sin embargo, mostró un valor de CC50 (105,9 ± 10,0 µM) superior (p< 0,05) con respecto a los fármacos de referencia (atazanavir (CC50= 25,0 ± 0,5 µM), sulfadiazina (CC50= 25,2 ± 3,2 µM) y pirimetamina (CC50= 4,4 ± 1,2 µM). En conclusión, este trabajo describe por primera vez la actividad in vitro del tipranavir sobre taquizoitos de T. gondii.

The introduction of highly efficient antiretroviral therapy has brought about a decrease in the frequency of neurotoxoplasmosis among people with HIV. It was demonstrated experimentally that protease inhibitor antiretrovirals may also have a direct action against the parasite, in this case Toxoplasma gondii. The purpose of the study was to evaluate the antitoxoplasma activity in vitro of tipranavir, a third-generation protease inhibitor antiretroviral. To achieve this aim, determination was made of the growth inhibition caused by tipranavir in Toxoplasma gondii intracellular tachyzoites, as well as its cytotoxicity against macrophages living in the peritoneum of OF-1 mice. Additionally, evaluation was conducted of atazanavir, sulfadiazine and pyrimethamine as reference drugs. Tipranavir displayed inhibitory activity against T. gondii tachyzoites, with a IC50 of 21.2 ± 3,0 µM, similar (p> 0.05) to the one obtained with sulfadiazine (IC50= 23.3 ± 3.6 µM) and higher (p< 0.05) than atazanavir (IC50= 2.8 ± 0.7 µM) and pyrimethamine (IC50= 1.2 ± 0.2 µM). However, its CC50 value (105.9 ± 10.0 µM) was higher (p< 0.05) than that of the reference drugs atazanavir (CC50= 25.0 ± 0.5 µM), sulfadiazine (CC50= 25.2 ± 3.2 µM) and pyrimethamine (CC50= 4.4 ± 1.2 µM). This is the first time a description is provided of the in vitro activity of tipranavir against T. gondii tachyzoites.

Antiretroviral activity of protease inhibitors against Toxoplasma gondii / Terapia antiretroviral de inibidores da protease contra Toxoplasma gondii

The introduction of highly active antiretroviral therapy (HAART) has caused a marked reduction in the occurrence and severity of parasitic infections, including the toxoplasmic encephalitis (TE). These changes have been attributed to the restoration of cell-mediated immunity. This study was developed to examine the activity of six antiretroviral protease inhibitors (API) on Toxoplasma gondii tachyzoites. The six API showed anti-Toxoplasma activity, with IC50 value between 1.4 and 6.6 µg/mL. Further studies at the molecular level should be performed to clarify if the use of API could be beneficial or not for AIDS patients with TE.

La introducción de la terapia antirretroviral de alta efectividad ha causada una marcada reducción en la ocurrencia y curso clínico de las infecciones parasitarias, incluyendo la toxoplasmosis encefálica (TE). Estos cambios han sido atribuidos a la restauración celular. Este estudio fue desarrollado para examinar la actividad de seis inhibidores de proteasas antirretrovirales (IPA) sobre taquizoitos de Toxoplasma gondii. Los seis IPA mostraron actividad anti-Toxoplasma, con valores de CI50 entre 1.4 y 6.6 µg/mL. Futuros estudios a nivel molecular deben ser realizados, los cuales podrán delucidar si el uso de IPA pudiera beneficiar o no a los pacientes que sufren de TE.