RESUMEN
ABSTRACT Melatonin (MLT) is a hormone responsible for regulating several physiological processes. It has been shown that MLT can be an important mediator in bone formation and stimulation, promoting osteoblast differentiation. In clinical practice, in tissue regeneration procedures, it is necessary to use membranes or barriers, associated with biomaterials, or not. The aim of this in vitro study was to assess the effect of melatonin on the activity of osteoblastic cells, associated, or not, with a resorbable collagen membrane (Bio-Gideä). For this, mice-derived pre-osteoblastic cells MC3T3 obtained from the ATCC (American Type Culture Collection) were used. Cultured cells were subject to the following treatments: MLT with a concentration of 1mM, a Bio-Gideä membrane and a membrane associated with MLT (Bio-Gideä + MLT). Proliferation and cell viability assays and protein lysate (ELISA test) quantification for the BMP-2 protein were carried out, in periods of 72 hours, 7 days and 10 days. After analyzing the data (one-way ANOVA, alpha=5%) it was observed that when MLT was used in isolation, there was an increase in cell proliferation and viability in osteoblastic cells (p<0.05). But, when MLT was associated with resorbable membranes, there was an inverse behavior, both in terms of proliferation and viability (p<0.05). In the case of the ELISA test, no secretion of BMP-2 was detected in any of the analyzed groups. It is concluded that MLT has a stimulatory effect on osteoblasts, but, when associated with Bio-Gideä resorbable membranes, it does not show any viable action in osteoblastic cell stimulation.
RESUMO A melatonina (MLT) é um hormônio responsável pela regulação de diversos processos fisiológicos no nosso organismo. Tem sido demonstrado que a melatonina possa ser um importante mediador na formação e estimulação óssea, promovendo a diferenciação dos osteoblastos. Clinicamente, para o procedimento de regeneração tecidual, faz-se necessário a utilização de membranas ou barreiras, associadas ou não a biomateriais. Assim, o objetivo deste estudo in vitro foi avaliar o efeito da melatonina na atividade de células osteoblásticas, associada ou não a uma membrana de colágeno reabsorvível (Bio-Gide®). Para isto foram utilizadas células pré-osteoblásticas MC3T3 do ATCC (American Type Culture Collection), de camundongos. As células em cultura foram submetidas aos seguintes tratamentos: MLT na concentração de 1mM, membrana Bio Gide® e membrana associada à MLT (Bio-Gide® + MLT). Foram realizados os ensaios de proliferação e viabilidade celular e quantificação do lisado proteico (teste ELISA), para a proteína BMP-2, nos períodos de 72 horas, 7 e 10 dias. Após a análise dos dados (ANOVA um critério, alfa=5%) pode-se observar que a MLT quando utilizada sozinha, resultou em um aumento na proliferação e viabilidade celular nas células osteoblásticas (p<0,05). Entretanto, quando a MLT foi associada à membrana reabsorvível foi observado um comportamento inverso, tanto na proliferação quanto na viabilidade (p<0,05). Para o teste ELISA realizado, não houve secreção detectável de BMP-2 para nenhum grupo analisado. Conclui-se que a melatonina possui uma ação estimuladora nos osteoblastos, mas quando associada à membrana reabsorvível Bio-Gide®, não demonstra uma ação viável na estimulação de células osteoblásticas.
RESUMEN
ABSTRACT Melatonin (MLT) is a potential signaling molecule in the homeostasis of bone metabolism and may be an important mediator of bone formation and stimulation. The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of MLT on the viability, mRNA/protein expression and mineralization of pre-osteoblastic cells. The concentrations 5, 2.5, 1, 0.1 and 0.01 mM MLT were tested on pre-osteoblastic cells (MC3T3) compared to control (no MLT), evaluating proliferation and cell viability (C50), gene expression (RT-PCR) and secretion (ELISA) of COL-I and OPN at 24h, 48h and 72h, and the formation of mineral nodules (alizarin red and fast red) after 10 days of treatment. MLT at 5 and 2.5 mM proved to be cytotoxic (C50), so only 0.01, 0.1 and 1 mM were used for the subsequent analyses. OPN mRNA expression increased with MLT at 0.1 mM - 1 mM, which was followed by increased secretion of OPN both at 24h and 72h compared to the remaining groups (p <0.05). COL-I mRNA and COL-1 secretion followed the same pattern as OPN at 0.1 mM MLT at 72h of treatment (p <0.05). Regarding mineralization, all MLT doses (except 1mM) caused an increase (p <0.05) in the formation of mineral nodules compared to the control. Melatonin at 0.01mM - 1mM had a stimulatory effect on osteoblasts by upregulating COL-I and OPN expression/ secretion and mineralization, thereby fostering osteogenesis.
RESUMO A melatonina (MLT) é uma molécula potencial de sinalização na homeostase do metabolismo ósseo e pode ser um importante mediador da formação e estimulação óssea. O objetivo deste estudo in vitro foi avaliar o efeito da MLT na viabilidade, na expressão do mRNA da proteína e mineralização de células préosteoblásticas. As concentrações de MLT 5, 2,5, 1, 0,1 e 0,01 mM foram testadas em células pré-osteoblásticas da linhagem MC3T3 em comparação ao controle (sem MLT), avaliando a proliferação e a viabilidade celular (C50), expressão gênica (rtPCR) e secreção (Elisa) de Colágeno tipo 1 (COL-I) e osteopontina (OPN) às 24, 48 e 72 horas, além da formação de nódulos minerais por meio do teste vermelho de Alizarina fast red após 10 dias de tratamento. MLT a 5 e 2,5 mM provou ser tóxico (C50). Portanto, as concentrações de 0,01, 0,1 e 1 mM foram utilizadas para as análises subsequentes. A expressão do mRNA da OPN aumentou com MLT a 0,1 mM-1mM, seguida pela secreção aumentada de OPN às 24 e 72 horas em comparação aos demais grupos (p<0,05). O mRNA de COL-I e a secreção de COL-I seguiram o mesmo padrão do OPN a 0,1 mM de MLT em 72 horas de tratamento (p<0,05). Em relação à mineralização, todas as doses de MLT (exceto 1mM) causaram aumento (p<0,05) na formação de nódulos minerais em comparação ao controle. A MLT na concentração entre 0,01mM a 1 mM teve um efeito estimulador sobre os osteoblastos, ao regular positivamente a expressão e secreção de COL-I e OPN, além da mineralização, favorecendo a osteogênese.