Anticuerpos de cadena única de alpaca para la detección de antígenos de Fasciola hepática / Single-chain antibodies from alpaca for the detection of Fasciola hepatica antigens

RESUMEN Objetivo. Producir anticuerpos recombinantes de cadena única de alpaca que se unan con alta afinidad y especificidad al antígeno excretado-secretado (ES) de Fasciola hepatica para el desarrollo de tecnologías nuevas de diagnóstico de fascioliasis humana y animal. Materiales y métodos. Se ha construido una genoteca de cADNde los dominios variables de anticuerpos de cadena única pesada, conocidos como VHH, a partir de células mononucleares de sangre periférica de una alpaca inmunizada con el antígeno ES de F. hepatica. La genoteca fue tamizada con el antígeno ES por despliegue diferencial de fagos (phage display), seleccionando diez VHH que se unen específicamente a ES. El VHH anti ES fue clonado en un vector de expresión, la proteína recombinante (VHH-ES1) de 15,3 kDa fue producida por fermentación en E. coli y purificada a homogeneidad por cromatografía de afinidad. La unión del VHH-ES1 al antígeno ES fue evaluada por ELISA usando VHH-ES1 como anticuerpo de captura, antisuero policlonal anti-ES de conejo y conjugado anti IgG de conejo con peróxidasa de rábano. Resultados. Se ha identificado y producido un VHH-ES1 recombinante que se une al antígeno ES (VHH-ES1) que correspondía a un anticuerpo de la subclase IgG2 de bisagra larga. La unión del anticuerpo VHH-ES1 al antígeno muestra linealidad respecto a la concentración de ES en el rango de 50-5000 ng/mL y el valor límite de detección del antígeno está en el rango de 30-170 ng/mL de ES (R2=0,99). Conclusión . El VHH-ES1 se une con afinidad y especificidad al antígeno ES de F. hepatica y es un anticuerpo promisorio a evaluar para el desarrollo de nuevas tecnologías de diagnóstico de fascioliasis.

ABSTRACT Objectives. To produce recombinant single-chain antibodies from alpaca that will bind to the excreted-secreted (ES) Fasciola hepatica antigen with high affinity and specificity, so as to develop new diagnostic technologies of human and animal fascioliasis. Materials and Methods. A gene bank of DNA of the variable dominions of heavy single-chain antibodies (VHH) has been created, based on mononuclear cells of peripheral blood of an alpaca immunized with the ES antigen of F. hepatica. The gene bank was screened with the ES antigen by differential phage display, selecting ten VHH that bind specifically to ES. The anti-ES VHH was cloned in an expression vector, the recombinant protein (VHH-ES1) of 15.3 kDa was produced by fermentation in E. coli and purified to homogeneity by affinity chromatography. The binding of VHH-ES1 to the ES antigen was evaluated by ELISA using VHH-ES1 as capture antibody, policlonal anti-ES serum of rabbit and conjugated rabbit anti IgG with radish peroxidase. Results. A VHH that binds to the ES antigen (VHH-ES1) has been identified through differential phage display and produced by fermentation in E. coli; this corresponds to an antibody of the long-hinge IgG2 subclass. The binding of the VHH-ES1 antibody to the antigen shows linearity with respect to the concentration of ES in the 50-5,000 ng/mL range and the limit of detection value of the antigen is in the 30-170 ng/mL range of ES (R2=0.99). Conclusions. The VHH-ES1 binds with affinity and specificity to the ES antigen of F. hepatica and is a promissory antibody to be assessed for the development of new fascioliasis diagnostic technologies.

Fasciolosis humana y animal en el Perú: impacto en la economía de las zonas endémicas / Human and animal fascioliasis in Peru: impact in the economy of endemic zones

Fasciola hepatica es el agente etiológico de la fasciolosis en el Perú. La fasciolosis es un problema de salud pública por la alta prevalencia de la infección humana, especialmente niños y un problema veterinario de importancia por las altas tasas de infección del ganado en la mayoría de regiones del País. La fasciolosis es endémica en la sierra y la costa, y esporádica en la región amazónica. La infección humana se reporta en 18 regiones y la animal en 21 de las 24 regiones del Perú. La transmisión humana ocurre en poblaciones andinas rurales dedicadas a la agricultura, pero hay un creciente número de casos en ciudades. Diferentes situaciones epidemiológicas de la infección humana se presentan: i) Regiones con casos no autóctonos, donde la infección es por consumo de vegetales contaminados traídos de zonas endémicas; ii) Regiones con poblados hipo- y mesoendémicos, transmisión local y prevalencia < 10 por ciento; y iii) Regiones con poblados hiperendémicos, transmisión local y prevalencia ≥ 10 por ciento. El parásito infecta a vacunos, ovinos, equinos, caprinos, porcinos, camélidos, cobayos y conejos. La pérdida ganadera anual por la fasciolosis es no menor de US$ 50 millones, estimada por la prevalencia de la infección y los decomisos de hígados de vacunos en mataderos. Es difícil estimar el impacto económico de la fasciolosis humana por su estatus de enfermedad desatendida, lo cierto es que la fasciolosis es endémica, y en algunos casos hiperendémica, en las regiones más pobres de nuestro país, donde la situación debe ser reconocida como una emergencia de salud pública.

Fasciola hepatica is the causative agent of fasciolosis in Peru; the disease is an important public health problem by the high prevalence of the human infection affecting mainly children and a major veterinary problem by the high rates of infected livestock. The human disease is endemic in the Sierra and the Coast but sporadic in the Amazonia, and reported in 18 Departments, while the animal infection in 21 of 24 Departments of Peru. Transmission occurs in Andean rural populations engaged in agriculture, but recently an increasing number of people became infected in the cities. The epidemiological situation in Peru includes i) Departments with non-autochtonous cases, where infection occurs by consumption of contaminated vegetables brought from endemic areas or infection is acquired by visit to endemic areas; ii) Departments with hypoendemic and mesoendemic villages, where transmission occurs by ingest of contaminated vegetables and prevalence ≤10 percent; and iii) Departments with hyper-endemic villages with human prevalence >10 percent, with an intense transmission by consumption of contaminated vegetables. The disease affects bovine, sheep, goat, swine, equine, South American camelids, rabbits and guinea pigs. The negative impact of fasciolosis in the livestock economy is not lesser than US$ 50 million per year, estimation based on the prevalence and the number of condemned livers in the abattoirs. It is difficult to estimate the economic impact of this infection in the human health due to its status of neglected disease, but fasciolosis is hyper-endemic in the poorest Andean areas of Peru where the situation has to be recognized as a public health emergency.

Fascioliasis in relatives of patients with Fasciola hepatica infection in Peru

Altas tasas de fasciolosis humana han sido descritas en varias regiones del Perú. Estudiamos 20 familias en una área endémica del Perú para determinar la proporción de infección con F. hepatica en los familiares de los sujetos diagnosticados y para identificar factores de riesgo asociados. El estudio incluyó un total de 93 sujetos, quienes contribuyeron con muestras de heces y sangre. Las edades comprendieron desde 1 a 53 años (media = 18.6; DS = 14.2). La prevalencia general de fasciolosis por exámenes de heces fue 33.3% (n = 83) y por serología, 51.9% (n = 86). La prevalencia en el grupo de edad I (< 19 años de edad) por pruebas coprológicas y serológicas fueron 61.4% y 75.9%, respectivamente; en el grupo II (> 19 años de edad) 15.4% y 37.5%. El principal factor de riesgo asociado con fasciolosis fue comer ensaladas (OR = 3.29, IC = 1.2-9.0, p = 0.02). En conclusión, la fasciolosis humana es altamente prevalente en familiares de los casos índices y el factor de riesgo más significante para adquirirla en la familia es comer ensaladas en las áreas endémicas.

Caracterización de las mutaciones en el gen rpoß asociadas a la resistencia a rifampicina en pacientes con tuberculosis pulmonar / Description of gene rpoß mutations associated with rifampicin resistance in patients with pulmonary tuberculosis

Antecedentes: la resistencia a rifampicina en M. tuberculosis involucra mutaciones en el gen rpoß que codifica a la subunidad ß de la ARN polimerasa. Objetivo: Identificar las mutaciones del gen rpoß, en cepas de M. tuberculosis asosciadas con resistencia a rifampicina aisladas de la Subregión de Salud Lima Norte, Perú. Materiales y métodos: Se cultivó en Lowestein - Jenseen 73 muestras de esputo de pacientes con tuberculosis pulmonar. A 62, con más de 10 colonias por tubo, se les comprobó susceptibilidad a isoniazida, rifampicina, estreptomicina y etambutol. Se realizó la extracción de ADN por PCR, clonación en el vector pGEM-T, transformación, selección de clonas recombinantes y secuenciamiento del ADN plasmídico para la determinación de los polimorfismos del gen rpoß. Resultados: 52 (83,9 por ciento) cepas fueron resistentes a rifampicina (Rif) y 10 (16,1 por ciento) susceptibles (Rif). Se encontró alteraciones en el gen rpoß en 51 de 52 cepas Rif. Se identificaron 20 mutaciones. Las mutaciones más frecuentes fueron encontradas en los codones Ser-531 (62,7 por ciento), His-526 (15,7 por ciento), Asp-516 (11,8 por ciento) y Gln-513 (5,9 por ciento). No se observó mutación alguna en las 10 cepas Rif. 94,2 por ciento de nuestras cepas Rif fueron también resistentes a isoniazida. Conclusiones: Se encontraron mutaciones en el gen rpoß de casi todas las cepas Rif; asimismo, casi todas las cepas Rif fueron también resistentes a isoniazida.