RESUMEN
@#[摘 要] 目的：设计并制备一种分别靶向B细胞表面抗原CD19和CD22的CAR-T细胞，检测其对肿瘤细胞的体内外杀伤效果。方法：将含有人源化 CD19 ScFv的二代CAR分子和带有CD3ε链作为共刺激结构域的CD22 ScFv CAR分子以P2A自剪切肽连接，序列连接于慢病毒载体pLTR-CMV-MCS中，以HEK-293T细胞包装相应的慢病毒载体，感染健康志愿者提供的T细胞制备CAR-19-22-T细胞，同时以相同二代结构分别构建单靶向CAR-T细胞作为参照。构建表达荧光素酶、CD19和/或CD22的前列腺癌3M细胞（靶细胞）。将各种CAR-T细胞与靶细胞共同培养，采用荧光素酶化学发光法和ELISA法检测其对靶细胞的杀伤能力和细胞因子的分泌水平。通过尾静脉注射Raji-Luc细胞构建NOD-SCID免疫缺陷小鼠白血病模型，分别注射各组CAR-T细胞进行治疗并评估其疗效。结果：培养7 d的CAR-19-22-T细胞的CAR-19表达率为13.7%，CAR-22表达率为14.3%。CAR-19-22-T细胞在10∶1效靶比时，对3M-CD19-Luc、3M-CD22-Luc和3M-CD19-CD22-Luc细胞的杀伤率均显著高于T细胞[（78.1±14.4）% vs （11.1±4.3）%、（46.7±10.7）% vs （12.4±2.7）%、（90.5±4.3）% vs （14.3±3.7）%，均P<0.01]；与3M-CD19-Luc、3M-CD22-Luc、3M-CD19-CD22-Luc靶细胞共培养后，CAR-19-22-T细胞IFN-γ、TNF-α和IL-2水平均显著低于CAR-19-T和CAR-22-T细胞（P<0.05或P<0.01）。CAR-19-22-T细胞对移植Raji-Luc细胞模型小鼠治疗效果明显，其生存期显著长于T细胞组（P<0.01），与CAR-19-T组和CAR-22-T组荷瘤小鼠比较差异均无统计学意义（均P>0.05）。结论：成功设计并制备了一种双靶点CAR-19-22-T细胞，其能够有效杀伤表达CD19和/或CD22抗原的肿瘤细胞，对Raji-Luc细胞的白血病模型小鼠有显著的治疗效果。