Diagnóstico molecular de larvas de Angiostrongylus spp. recuperadas de gastrópodes / Molecular diagnosis of Angiostrongylus spp. recovered from gastropods

Gastrópodes continentais atuam como hospedeiros intermediários de nematódeos de interesse para a saúde humana e animal, como Angiostrongylus spp. e outros pertencentes à superfamília Metastrongyloidea. O procedimento de digestão artificial é comumente utilizado para recuperar larvas de nematódeos em moluscos. Entretanto, essas formas imaturas não apresentam desenvolvidos os caracteres morfológicos necessários à sua identificação taxonômica. Como o produto da digestão artificial é ácido e contém restos de tecido do molusco, também surgem dificuldades para realizar o diagnóstico molecular destas larvas. Estudos pilotos mostraram ineficiência no diagnóstico molecular devido a variações na qualidade da amostra, baixa concentração de DNA e baixa eficiência nas Reações em Cadeia da Polimerase (PCR). O objetivo deste trabalho foi aprimorar o diagnóstico molecular de larvas de Angiostrongylus spp. obtidas de moluscos. Assim, inicialmente, foi padronizado um método de preparo das larvas (triagem das larvas com micropipeta, somado ao ajuste do pH com PBS 1X ). A partir destas amostras padronizadas quanto ao método de preparo, foram testados métodos de extração de DNA e diferentes iniciadores para a região do Citocromo c Oxidase subunidade I (COI). Foram utilizadas larvas L3 de Angiostrongylus cantonensis, A. costaricensis e A. vasorum provenientes de ciclos mantidos em laboratório.

Amostras do campo de Aelurostrongylus abstrusus também foram utilizadas para comparação. A importância do preparo da amostra foi testada através de reações de PCR realizadas em condições idênticas, com amostras padronizadas e não padronizadas quanto ao preparo. Quanto aos testes de extração, após a realização de pilotos com diferentes protocolos, foram selecionados para testes comparativos, até a etapa de sequenciamento, dois protocolos com choque térmico e um utilizando kit comercial. Estes foram avaliados quanto à quantidade de DNA, eficiência da amplificação, tempo de realização e qualidade da sequência. Em uma terceira etapa foram testados três diferentes iniciadores para o COI. Os resultados demonstraram que após uma lavagem com PBS o produto da digestão artificial torna-se neutro (pH 7,29 ± 0,13) e que estas amostras, devidamente triadas, apresentam taxa de amplificação 60% maior. Este passo mostrou-se essencial para o sucesso das demais etapas. As amostras que foram submetidas à extração de DNA com os três protocolos selecionados resultaram em um produto que permitiu a amplificação do fragmento do COI nas reações de PCR, apesar das baixas concentrações de DNA, tendo sido possível também o diagnóstico molecular, por sequenciamento de Sanger, de 100% dessas amostras.

Os protocolos com choque térmico apresentaram menor tempo de execução, custo e geração de resíduo químico. Os três iniciadores testados amplificaram com eficiência a região-alvo, viabilizando a identificação de Angiostrongylus spp. por sequenciamento. Os diferentes métodos de extração e iniciadores testados representam diferentes possibilidades para o diagnóstico de larvas de Angiostrongylus spp. e seu uso deverá levar em conta os recursos disponíveis (tempo e dinheiro) e o objetivo do estudo (diagnóstico ou pesquisa). A disponibilização de um protocolo eficiente e a possibilidade de redução dos custos no diagnóstico dos nematódeos associados a moluscos contribuem para incentivar as pesquisas na área e viabilizar estudos de vigilância epidemiológica e controle das angiostrongilíases. (AU)

Freshwater gastropods of the Baixada Maranhense Microregion, an endemic area for schistosomiasis in the State of Maranhao, Brazil: I - qualitative study

Introduction: The Baixada Maranhense Microregion currently has the highest prevalence of schistosomiasis in the State of Maranhão, likely because this parasitosis is characterized as an occupational disease, and increased contact with water increases the risk of infection by Schistosoma mansoni. This paper reports the results of the first comprehensive freshwater malacological survey performed in the Baixada Maranhense Microregion. Methods: Freshwater mollusks were collected from the twenty-one municipalities of the Baixada Maranhense Microregion and from Bacurituba and Cajapió and were evaluated for infection by trematodes. Results: A total of 9,129 mollusks were collected (sixteen species), which included the first records of six species in the State of Maranhão: Gundlachia radiata, G. ticaga, Hebetancylus moricandi, Plesiophysa guadeloupensis, Pomacea bridgesii diffusa and Omalonyx sp. Biomphalaria glabrata was found in five municipalities, whereas B. straminea was found in nine. Biomphalaria glabrata and B. straminea were observed in syntopy in Pinheiro and São Bento. Of the 990 specimens of B. glabrata and the 2,109 specimens of B. straminea that were exposed to and/or analyzed for the presence of larval trematodes, only a single specimen of B. glabrata (0.1%) from São Bento shed S. mansoni. Other larval trematodes were first observed in mollusks from the State of Maranhão. Conclusions: These results indicate that the study area is epidemiologically important due to the presence of two natural vectors of schistosomiasis and the active transmission of schistosomiasis, which was confirmed in the infected specimen that was collected in this study. .

Larval trematodes in freshwater gastropods from Mato Grosso, Brazil: diversity and host-parasites relationships

A survey for freshwater gastropods carrying trematodes parasites was conducted in Manso Dam and the surrounding areas frequented by tourist, focusing particularly on the Pantanal region. Infected snails were recovered from twelve of the eighteen investigated municipalities and forty-one cercaria-snail pairings were recorded. Among these pairings were several first records of snails serving as intermediate hosts for trematodes in Brazil including Biomphalaria amazônica Paraense, 1966, Biomphalaria occidentalis Paraense, 1981, Marisa planogyra Pilsbry, 1933, Pomacea maculata Perry, 1830, Pomacea scalaris (d'Orbigny, 1835) and Gundlachia radiata (Guilding, 1828). Echinostomatidae and Strigeidae were the most common trematode families (ca. 47%) and the greatest diversity of larvae were obtained from Drepanotrema lucidum (Pfeiffer, 1839). Paramphistomatidae, Schistosomatidae or Spirorchiidae and Notocotylidae or Pronocephalidae were recovered in D. lucidum for the first time extending the number of families which use this gastropod as intermediate host. Although no specimens were found harboring larval stages of Schistosoma mansoni Sambon, 1907 other trematode larvae were discovered, including the Schistosomatidae Brevifurcate apharingeate cercaria that can cause dermatitis in humans. Continued studies on the taxonomy and biology of trematodes are essential to better understand the biodiversity of these parasites as well as the epidemiological aspects for control of associated zoonosis.

Foi realizado um levantamento de trematódeos em gastrópodes límnicos provenientes da área da Usina Hidrelétrica de Manso e das proximidades com potencial turístico, como a região do Pantanal. Moluscos parasitados foram encontrados em doze dos dezoito municípios investigados e quarenta e uma interações cercária-gastrópode límnico foram observadas, entre elas Biomphalaria amazônica Paraense, 1966, Biomphalaria occidentalis Paraense, 1981, Marisa planogyra Pilsbry, 1933, Pomacea maculata Perry, 1830, Pomacea scalaris (d'Orbigny, 1835) and Gundlachia radiata (Guilding, 1828) atuando pela primeira vez no Brasil como hospedeiros intermediários de trematódeos. Echinostomatidae e Strigeidae foram as famílias de maior ocorrência (ca. 47%) e a maior variedade de tipos cercarianos foi encontrada em Drepanotrema lucidum (Pfeiffer, 1839). Paramphistomatidae, Schistosomatidae or Spirorchiidae and Notocotylidae or Pronocephalidae foram reportadas pela primeira vez em D. lucidum ampliando o número de famílias que utilizam esse gastrópode como hospedeiro intermediário. Embora nenhum espécime tenha sido encontrado com formas larvais de Schistosoma mansoni Sambon, 1907, outros trematódeos foram observados, como Brevifurcate apharingeate cercaria da família Schistosomatidae que pode causar dermatite no homem. Estudos sobre a taxonomia e a biologia de trematódeos são essenciais para melhor compreender a biodiversidade desses parasitos, assim como os aspectos epidemiológicos para o controle de parasitoses associadas.