RESUMEN
A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecciosa negligenciada, causada por parasitos intracelulares do gênero Leishmania e endêmica em países tropicais e subtropicais. O tratamento apresenta baixa eficácia, longo esquema terapêutico, dificuldades de administração e alta toxicidade. Diante disso, existe a necessidade de novas terapias, menos invasivas e mais eficazes. O reposicionamento de fármacos é uma estratégia promissora que consiste na pesquisa e identificação de novas indicações terapêuticas para fármacos já conhecidos. Trabalhos prévios demonstraram a atividade in vitro dos fármacos anti-histamínicos, cinarizina (CNZ), ciproeptadina (CPH) e meclizina (MCZ) em Leishmania (Leishmania) infantum. O presente estudo objetivou a investigação do mecanismo celular e do perfil de expressão gênica de L. infantum tratada com os fármacos anti-histamínicos. Em formas promastigotas foram avaliadas diferentes estruturas celulares, como compartimentos vesiculares ácidos, membrana plasmática e DNA genômico; moléculas, como adenosina trifosfato e íons, como cálcio. Em formas amastigotas foi avaliado o perfil de expressão de 29 genes alvo utilizando PCR em tempo real. Os fármacos anti-histamínicos apresentaram valores de concentração efetiva 50% entre 8 e 34 µM em promastigotas, após 2 horas, e em amastigotas, após 24 horas, entre 28 e 74 µM. A concentração citotóxica 50% em fibroblastos murinos foi maior que 59 µM. Em promastigotas, os anti-histamínicos causaram alcalinização de compartimentos vesiculares ácidos, aumento nos níveis de cálcio intracelular e redução dos níveis de ATP, mantendo o DNA genômico íntegro, indicando um desequilíbrio mitocondrial seguido de morte do parasito. Em amastigotas, os fármacos causaram alteração no perfil de expressão de quatro genes relacionados ao metabolismo antioxidante, ácidos graxos, proteínas integrais de membrana e via glicolítica. Em conclusão, os fármacos CNZ, CPH e MCZ são ativos contra ambas formas de vida de L. infantum provocando um desequilíbrio do sistema bioenergético e alteração de genes alvo. Os fármacos anti-histamínicos podem ser usados para determinar vias de morte e alvos celulares, além de servir como inspiração para o desenho de novos protótipos de fármacos. Os genes alvo potenciais identificados podem ser explorados como marcadores moleculares putativos da atividade antiparasitária.
Visceral leishmaniasis (VL) is a neglected infectious disease, caused by intracellular parasites of the genus Leishmania and endemic in tropical and subtropical countries. The treatment has low efficacy, a long therapeutic regimen, administration difficulties and high toxicity. Therefore, there is a need for new, less invasive, and more effective therapies. Drug repositioning is a promising strategy that consists of researching and identifying new therapeutic indications for already known drugs. Previous work demonstrated the in vitro activity of the antihistamine drugs, cinnarizine (CNZ), cyproheptadine (CPH) and meclizine (MCZ) on Leishmania (Leishmania) infantum. The present study aimed to investigate the cellular mechanism and gene expression profile of L. infantum treated with antihistamine drugs. In promastigote forms, different cellular structures were evaluated, such as acidic vesicular compartments, plasma membrane and genomic DNA; molecules, such as adenosine triphosphate and ions, such as calcium. In amastigote forms, the expression profile of 29 target genes was evaluated using real-time PCR. Antihistamine drugs showed 50% effective concentration values between 8 and 34 µM in promastigotes, after 2 hours, and in amastigotes, after 24 hours, between 28 and 74 µM. The 50% cytotoxic concentration in murine fibroblasts was greater than 59 µM. In promastigotes, antihistamines caused alkalinization of acidic vesicular compartments, increased intracellular calcium levels and reduced ATP levels, maintaining intact genomic DNA, indicating a mitochondrial imbalance followed by parasite death. In amastigotes, the drugs caused changes in the expression profile of four genes related to antioxidant metabolism, fatty acids, integral membrane proteins and the glycolytic pathway. In conclusion, the drugs CNZ, CPH and MCZ are active against both life forms of L. infantum, causing an imbalance in the bioenergetic system and alteration of target genes. Antihistamine drugs can be used to determine cell death pathways and targets, in addition to serving as inspiration for the design of new drug prototypes. The identified potential target genes can be explored as putative molecular markers of antiparasitic activity.
RESUMEN
A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecciosa sistêmica, causada pelos parasitos protozoários do gênero Leishmania, endêmica em países tropicais e subtropicais. Por acometer principalmente populações de baixa renda em países em desenvolvimento e subdesenvolvidos, a leishmaniose se encaixa no perfil das doenças negligenciadas, em razão de seu baixo retorno financeiro para a indústria farmacêutica. Devido ao alto custo, restrições e efeitos colaterais dos atuais fármacos utilizados na terapêutica da leishmaniose, há a real necessidade de identificar e desenvolver novas alternativas como a de reposicionamento de fármacos, que se trata de uma nova indicação terapêutica para um fármaco já disponibilizado no mercado. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antileishmania de fármacos anti-histamínicos e identificar marcadores celulares e moleculares relacionados à resposta terapêutica, usando um sistema de infecção in vitro. Foram realizados em Leishmania (Leishmania) intantum: i) a triagem de quatro fármacos anti-histamínicos, sendo eles: cetirizina (CTZ), ciproeptadina (CPH), fexofenadina (FXF) e meclizina (MCZ); ii) o estudo das alterações celulares e moleculares com o fármaco cinarizina (CNZ) e os que apresentaram atividade contra a forma amastigota. Para isto, foi feito estudos de concentração efetiva 50% (CE50) em promastigota e amastigota de L. (L.) infantum, concentração citotóxica 50% (CC50) em células de mamífero e após foram analisadas a permeabilidade de membrana plasmática, o potencial de membrana mitocondrial, a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e a produção de tióis por meio de ensaios fluorimétricos e as ultra-estruturas celulares por microscopia eletrônica de transmissão e o perfil de expressão gênica por qPCR. Os resultados mostraram que CPH e MCZ apresentaram atividade antileishmania contra promastigotas, com CE50 de 7 e 22 µM, respectivamente. CPH e MCZ eliminaram os amastigotas, com CE50 de 30 e 35 µM, respectivamente. Os fármacos CTZ e FXF não apresentaram atividade contra ambas as formas do parasito. CNZ, CPH e MCZ provocaram em promastigota: i) alteração na permeabilidade da membrana plasmática; ii) despolarização do potencial de membrana mitocondrial, provocando danos celulares associados com o sistema bioenergético; iii) alteração no perfil de expressão gênica de 11 genes que codificam para diferentes funções celulares. Estes dados, além de apresentarem resultados direto para o tratamento das leishmanioses, com o desenvolvimento de novas alternativas, apresenta um grande potencial como sistema de avaliação de resposta terapêutica de vários tipos de fármacos.