Antitumoral effects of Amblyomma sculptum Berlese saliva in neuroblastoma cell lines involve cytoskeletal deconstruction and cell cycle arrest / Efeito antitumoral da saliva do carrapato Amblyomma sculptum Berlese em células de neuroblastoma envolve desconstrução do citoesqueleto e parada do ciclo celular

Abstract The antitumor properties of ticks salivary gland extracts or recombinant proteins have been reported recently, but little is known about the antitumor properties of the secreted components of saliva. The goal of this study was to investigate the in vitro effect of the saliva of the hard tick Amblyomma sculptum on neuroblastoma cell lines. SK-N-SK, SH-SY5Y, Be(2)-M17, IMR-32, and CHLA-20 cells were susceptible to saliva, with 80% reduction in their viability compared to untreated controls, as demonstrated by the methylene blue assay. Further investigation using CHLA-20 revealed apoptosis, with approximately 30% of annexin-V positive cells, and G0/G1-phase accumulation (>60%) after treatment with saliva. Mitochondrial membrane potential (Δψm) was slightly, but significantly (p < 0.05), reduced and the actin cytoskeleton was disarranged, as indicated by fluorescent microscopy. The viability of human fibroblast (HFF-1 cells) used as a non-tumoral control decreased by approximately 40%. However, no alterations in cell cycle progression, morphology, and Δψm were observed in these cells. The present work provides new perspectives for the characterization of the molecules present in saliva and their antitumor properties.

Resumo As propriedades antitumorais de extratos de glândulas salivares de carrapatos ou proteínas recombinantes foram relatadas recentemente, mas pouco se sabe sobre as propriedades antitumorais dos componentes secretados da saliva. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito in vitro da saliva bruta do carrapato duro Amblyomma sculptum sobre as linhagens celulares de neuroblastoma. Células SK-N-SK, SH-SY5Y, Be(2)-M17, IMR-32 e CHLA-20 foram suscetíveis à saliva, com redução de 80% na sua viabilidade em comparação com controles não tratados, como demonstrado pelo ensaio de Azul de Metileno. Investigações posteriores utilizando CHLA-20 revelaram apoptose, com aproximadamente 30% de células positivas para anexina-V, e G0/G1 (> 60%) após tratamento com saliva. O potencial de membrana mitocondrial (Δψm) foi reduzido significativamente (p <0,05), e o citoesqueleto de actina foi desestruturado, como indicado pela microscopia de fluorescência. A viabilidade do fibroblasto humano (células HFF-1), usado como controle não tumoral, diminuiu em aproximadamente 40%. No entanto, não foram observadas alterações na progressão do ciclo celular, morfologia e Δψm nestas células. O presente trabalho fornece novas perspectivas para a caracterização das moléculas presentes na saliva e suas propriedades antitumorais.

Conventional and volatile salts as precipitating agents for recombinant antiviral protein / Sais convencionais e voláteis como agentes de precipitação para proteína recombinante com ação antiviral

Recombinant proteins expressed in cell culture have been shown to be relevant in the biopharmaceutical production focusing human health. The current work investigated the precipitation process of recAVLOEc protein, synthesized by E. coli BL21 (DE3) pLysS cells. The system is used for the AVLO expression that shown antiviral activity and it was found in the hemolymph of Lonomia obliqua caterpillar. The precipitation was conducted by the use of conventional salts (ammonium sulfate and sodium sulfate) and the volatile ammonium carbamate salt. Initially, the precipitated protein obtained from bacterial lysate was added to L929 cells to evaluate the cytotoxic effect; and besides Vero cells were infected with measles virus to verify the antiviral action of the precipitated recombinant protein. Toxic effect on the culture of L929 cells was observed for the precipitate obtained by the use of ammonium sulfate and sodium sulfate. In addition, tests in L929 cell cultures infected with EMC virus showed that samples of precipitated protein by salts did not show antiviral action. In Vero cell cultures, the precipitated protein by sodium sulfate showed antiviral action for measles virus.

Proteínas recombinantes expressas em culturas celulares têm se mostrado importantes na produção de fármacos de interesse para a saúde humana. Este estudo investigou a precipitação da proteína recAVLOEc, sintetizada por células de E. coli BL21 (DE3) pLysS, utilizadas como sistema de expressão da AVLO, proteína com atividade antiviral, originalmente encontrada na hemolinfa da lagarta Lonomia obliqua. A precipitação foi conduzida por meio do uso de sais convencionais (sulfato de amônio e de sódio) e do sal volátil carbamato de amônio. Inicialmente o precipitado proteico obtido do lisado bacteriano foi administrado em culturas de células L929 para avaliar o efeito citotóxico e posteriormente em células Vero infectadas com o vírus do sarampo, para a verificação da ação antiviral. Um efeito tóxico em culturas de L929 foi observado para os precipitados obtidos pelo uso de sulfato de amônio e de sódio. Testes em culturas de L929 infectadas com o vírus EMC foram também efetuados e as amostras de proteínas precipitadas com os sais convencionais e o sal volátil não resultaram em ação antiviral. Em culturas de células Vero, o uso do sulfato de sódio como agente de precipitação das proteínas contidas no lisado bacteriano resultou em ação antiviral para o sarampo.

Gut transcriptome analysis on females of Ornithodoros mimon (Acari: Argasidae) and phylogenetic inference of ticks / Transcriptoma do intestino de fêmeas de Ornithodoros mimon (Acari: Argasidae) e inferência filogenética de carrapatos

Abstract Ornithodoros mimon is an argasid tick that parasitizes bats, birds and opossums and is also harmful to humans. Knowledge of the transcripts present in the tick gut helps in understanding the role of vital molecules in the digestion process and parasite-host relationship, while also providing information about the evolution of arthropod hematophagy. Thus, the present study aimed to know and ascertain the main molecules expressed in the gut of argasid after their blood meal, through analysis on the gut transcriptome of engorged females of O. mimon using 454-based RNA sequencing. The gut transcriptome analysis reveals several transcripts associated with hemoglobin digestion, such as serine, cysteine, aspartic proteases and metalloenzymes. The phylogenetic analysis on the peptidases confirmed that most of them are clustered with other tick genes. We recorded the presence a cathepsin O peptidase-coding transcript in ticks. The topology of the phylogenetic inferences, based on transcripts of inferred families of homologues, was similar to that of previous reports based on mitochondrial genome and nuclear rRNA sequences. We deposited 2,213 sequence of O. mimon to the public databases. Our findings may help towards better understanding of important argasid metabolic processes, such as digestion, nutrition and immunity.

Resumo Ornithodoros mimon é um carrapato argasídeo parasita de morcegos, aves e marsupiais, além de ser bastante agressivo aos humanos. O conhecimento dos transcritos presentes no intestino dos carrapatos auxilia no entendimento do papel de moléculas vitais no processo de digestão e na relação parasito-hospedeiro, além de fornecer também informações sobre a evolução dos artrópodes hematófagos. Desta maneira, o presente estudo teve como objetivo conhecer e identificar as principais moléculas expressas no intestino de uma espécie de carrapato argasídeo após o repasto sanguíneo, através de uma análise transcritômica descritiva do intestino de fêmeas ingurgitadas de O. mimon, utilizando um sequenciamento de RNA de nova geração da plataforma 454. Além de inferir a relação filogenética de carrapatos através de um conjunto de dados transcritômicos. O transcriptoma do intestino revelou diversos transcritos associados com a digestão da hemoglobina, como proteinases das classes serino, cisteína, aspártica e metalo. Registramos a presença de um transcrito de uma cisteína peptidase do tipo catepsina O em carrapatos. A inferência filogenética baseada em conjunto de dados transcritos homólogos tem uma resolução topológica similar a de outros conjuntos de dados moleculares. Foram depositados no banco de dados gênico público 2213 transcritos de O. mimon. Os achados obtidos no presente estudo podem contribuir para compreensão dos importantes processos, como digestão, nutrição e imunidade dos carrapatos da família Argasidae, além de fornecer informações sobre a filogenia da ordem Ixodida.

Comparative study on PCR and microbiological culture performance for identifying Mycobacterium tuberculosis complex and Mycobacterium bovis specie in bovine samples

The present study aimed at evaluating the concordance between PCR and microbiological culture techniques for analysing organs samples from cattle with suspected lesions of tuberculosis. Fifty-twosamples collected from slaughter houses were analyzed by microbiological culture, and the extracted DNA was amplified by PCR using NZ1 and NZ2 primers. These primers identify the mycobacteria belongingto M. tuberculosis complex, and the primers pair pncA differentiate the M . bovis from M. tuberculosis species. The colonies isolated from 30 samples were suspended, and the extracted DNA was amplifiedby PCR using the same primer pairs. Although the agreement has been considered weak (k = 0.175) between microbiological culture and PCR performed directly in clinical samples using NZ1 and NZ2 primers, the two pairs of primers could amplify the target genes when 100% of the extracted DNA from 30 isolated colonies were used. Thus, PCR employing pncA primer pair enabled to identify M.bovis in the isolated colonies at a short time when compared with the biochemical assays. The concomitant use of PCR and bacteriologic culture techniques hastens the confirmation of detected agent, which is essential inconducting the epidemiological studies and in taking preventive control measures.

Co-infection between influenza virus and flagellated bacteria

Tripsina é necessária na ativação da clivagem do vírus influenza A in vitro. Esta clivagem é importante para entrada do vírus na célula por endocitose mediada pelo receptor celular. Bactérias presentes no trato respiratório são fontes de proteases que podem contribuir na replicação do vírus influenza in vivo. Entre 47 amostras coletadas de cavalos, suínos e humanos, a influenza foi isolada e confirmada em 13 que estavam co-infectadas com bactéria flagelada: Stenotrophomonas maltophilia desde o início destes experimentos. Apesar do tratamento das amostras com antibióticos, as bactérias resistiram em diversas delas (48.39%). A protease (elastase), secretada pela Stenotrophomonas maltophilia, desenvolveu papel decisivo na potencialização da infecção pelo vírus influenza. Essa atividade proteolítica foi detectada pelo teste de ágar-caseína. Amostras positivas para o vírus influenza isolado em animais, bem como em humanos tiveram potencialização da infectividade (ECP) em células MDCK e NCI-H292, sempre que a Stenotrophomonas maltophilia esteve presente. Os referidos microorganismos, bactéria e vírus foram observados ultra-estruturalmente. Esses achados in vitro demonstram como complicações respiratórias podem ocorrer in vivo, através da contribuição de protease microbiana, provocando aumento da inflamação ou destruição dos inibidores celulares de proteases endógenas, nos hospedeiros susceptíveis à influenza.

Performance evaluation of CHO-K1 cell in culture medium supplemented with hemolymph

Desenvolvimento de meios de cultura isentos de soro fetal bovino (SFB) é uma das grandes prioridades de pesquisa em desenvolvimento de processos com célula animal. O objetivo do presente trabalho foi realizar uma análise do potencial de uso da hemolinfa como suplemento do meio utilizado no cultivo da célula animal ancorante CHO-K1. Para isso, foi adicionado 1% v/v de extrato de hemolinfa ao meio DMEM contendo 10% v/v de SFB e 1,0 ou 4,5 g/L de glicose. O cultivo foi realizado em frascos tipo spinner em um ambiente de 10% v/v de CO2, a 37ºC, utilizando o microcarregador Cytodex 1. Comparando os resultados obtidos no ensaio com hemolinfa com um sem hemolinfa pode-se notar uma influência positiva da hemolinfa no cultivo, já que o ensaio com hemolinfa apresentou uma concentração máxima de células 52% maior e uma produtividade máxima de até 40% maior.

Effect of cell culture system on the production of human viral antigens

Foi realizado estudo comparativo na produção de diferentes antígenos virais usando sistema de microcarregador e sistema tradicional. Células Vero, BHK e MA-104 foram cultivadas em microcarregadores (2mg/ml) utilizando-se biorreatores com capacidade de 3,7 litros e, em paralelo, no sistema convencional com garrafas Roux. Após quatro dias de cultura para as células BHK e sete dias para as células Vero e MA-104, as células foram infectadas com 0,1 MOI (multiplicidade de infecção) de vírus da raiva, vírus do sarampo, poliovírus e rotavírus. Foi determinado o rendimento das células e dos vírus em microcarregadores e sistema convencional. Foi observado no sistema de microcarregador um aumento médio obtido de vinte vezes mais células/ml em relação à cultura convencional em monocamadas, usando garrafas Roux. Por outro lado, as células que cresceram em garrafas Roux apresentaram 1,6 a 6,7 mais vírus/ml em culturas do que no sistema de microcarregador. Contudo o total das amostras em termos de vírus por grupo foi estatisticamente similar para ambos os sistemas (p > 0,05). O rendimento na produção de antígeno viral pode depender não somente da concentração das células, mas também de outros fatores da cultura, como características do suporte no crescimento. Assim, o estudo deste parâmetro pode proporcionar uma linha de base para um futuro melhoramento e estratégias para se estabelecer um aumento em escala na produção de vírus, já que, dependendo do tipo de vírus, a ótima condição encontrada para uma produção de vírus em pequena escala pode não ser adequada para a produção em grande escala, requerendo novas padronização e avaliação.

Measles serodiagnosis: production and evaluation of the IgM-measles ELISA(IAL) reagent

Recent measles outbreaks in different countries led to an increase of laboratory measles diagnosis. Thus, we developed the IgM-Measles ELISAIAL, using measles virus antigens obtained from cell cultured in microcarriers in order to supply reagent kits to Brazilian public health laboratories. A batch of antigenic reagent was produced and evaluated in the enzyme immunoassay in comparison with clinical diagnosis and with as reference assay (IgM Capture ELISA(CDC)) data. This study was performed in a positive panel with 70 serum samples from patients with measles, and a negative panel with 132 samples from patients with unrelated diseases and without recent measles or vaccination history. In relation to other diagnostic methods, the IgM ELISAIAL presented sensitivity higher than 97.1 per cente, specificity and precision of 97 per cente, and agreement kappa (k) index higher than 0.94 (P < 0.05). Moreover, the IgM antibody profile from measles acute phase revealed by the assay was similar to the reference assay. A practical analysis system for checking the quality of new reagent batches was proposed based on the diagnostic features and agreement kappa index. Our findings suggest that measles antigenic reagents can be produced with reliable quality control system, and supplied to public health laboratories for routine serodiagnosis or population surveys.

Produçäo de um antígeno de sarampo por multiplicidade de infecçäo, com rendimento e reprodutibilidade / The role of m.o.i. in standardization of measles antigen preparation

Sarampo é uma doença potencialmente grave e comum, cuja vacinaçäo previne ou atenua as manifestaçöes clínicas. Métodos sorológicos utilizados na detecçäo de anticorpos para o vírus do sarampo têm sido empregados, como o teste de inibiçäo da hemaglutinaçäo e ELISA. Para produçäo de antígeno do sarampo com maior rendimento, e melhor reprodutibilidade, realizamos estudos com diferentes multiplicidades de infecçäo (M.I). Nossos resultados levam-nos a sugerir que a produçäo de antígenos de sarampo é mais eficiente com a utilizaçäo de multiplicidade de infecçäo (M.I) de 0,01 com boa reprodutibilidade, tanto na preparaçäo de ensaios de HA como de ELISA, devendo servir de parâmetro na preparaçäo de antígenos em larga escala para uso em ensaios diagnósticos