RESUMEN
Objective Salivary cortisol measurement plays an important role in the evaluation of adrenal function. Its high correlation with free serum cortisol, the easy of sampling and the limited presence of interfering steroids, generated multiple recent studies of its application, in special in the screening of adrenal hyperfunction. In this paper we present our experience in the development of a high pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method for salivary cortisol and cortisone measurement. Materials and methods For this study we used 181 saliva samples from our routine diagnostic laboratory. The HPLC-MS/MS method was based on a Waters Quattro Premier tandem mass spectrometer with an electrospray probe. After derivatization with hydroxylamine transitions monitored included cortisol and cortisone. An in-house radioimmunoassay (RIA) was used for salivary cortisol results comparison. Results Functional sensitivity was 24 ng/dL for cortisol and linearity from 24 to 1929 ng/dL. Saliva cortisol values obtained in the 181 samples presented a median of 52 ng/dL with 5‐95% percentile of 24 and 374 ng/dL. With the RIA the results were 86, 25 and 436 ng/dL, respectively, with values for RIA being significantly higher (P<0.0001) and high correlation (r=0.8312, P<0.0001). Cortisone measured in 159 samples showed a median of 278 ng/dL, with 5‐95% percentile of 100 and 1,133 ng/dL. Correlation with cortisol values was significant (r=0.820, P<0.0001). Conclusion We conclude that the HPLC-MS/MS method compares favorably with the RIA for salivary cortisol measurement, with the additional possibility of concomitant cortisone measurement and the evaluation of 11βHSD2 activity. .
Objetivo A dosagem de cortisol salivar é uma metodologia que vem tendo crescente aceitação no estudo da função adrenocortical. Sua alta correlação com a fração livre sérica, facilidade de coleta e presença limitada de interferentes têm originado múltiplas publicações, em especial no screening de pacientes suspeitos de hiperfunção. Neste trabalho apresentamos nossa experiência no desenvolvimento de metodologia baseada em cromatografia líquida e espectrometria de massas (HPLC-MS/MS) para a medida de cortisol e cortisona salivares. Materiais e métodos Para este estudo utilizamos 181 amostras de saliva de nossa rotina diagnóstica. A metodologia de HPLC-MS/MS baseou-se num espectrômetro de massas Waters Quattro Premier. Após derivatização com hidroxilamina, as transições monitoradas incluíram cortisol e cortisona. Um radioimunoensaio (RIE) in house foi empregado para comparação. Resultados A sensibilidade funcional para cortisol foi de 24 ng/dL, com linearidade entre 24 e 1,929 ng/dL. Os valores de cortisol obtidos nas 181 amostras apresentaram mediana de 52 ng/dL, com percentis 5‐95% de 24 e 374 ng/dL. Com o RIE, os resultados foram 86, 25 e 436 ng/L, respectivamente, com os valores obtidos no RIE significativamente mais elevados (P<0,0001), e alta correlação (r=0,8312, P<0,0001). Cortisona, medida em 159 amostras, mostrou mediana de 278 ng/dL, com percentis 5‐95% entre 100 e 1.133 ng/dL. A correlação com os valores de cortisol foi significativa (r=0,820, P<0,0001). Conclusão Concluímos que o método baseado em HPLC-MS/MS compara-se favoravelmente com o RIE para a medida de cortisol salivar, com a possibilidade adicional da medida concomitante de cortisona e avaliação da atividade da enzima 11βHSD2. .
Asunto(s)
Humanos , Cromatografía Líquida de Alta Presión , Cortisona/análisis , Hidrocortisona/análisis , Saliva/química , Espectrometría de Masas en Tándem/métodos , /metabolismo , Radioinmunoensayo/métodos , Sensibilidad y EspecificidadRESUMEN
INTRODUÇÃO: O teste de supressão com 1 mg de dexametasona (TSDx) é amplamente empregado no rastreamento da síndrome de Cushing (SC) dada sua elevada acurácia diagnóstica. A SC é um distúrbio endocrinometabólico resultante do hipercortisolismo crônico com característica de ausência de supressão do cortisol no TSDx. OBJETIVO: Desenvolver um radioimunoensaio (RIE) para a dosagem de dexametasona (Dx) no soro para complementar o TSDx. MÉTODOS: Foram imunizados três coelhos com o conjugado dexametasona-21-hemissuccinato-BSA para escolha do melhor anticorpo e o RIE foi desenvolvido de acordo com as recomendações da RE 899/2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Analisamos 96 voluntários, sendo 67 submetidos ao TSDx e 29 não, e 12 pacientes com SC, estudados na Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) e na Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. RESULTADOS: O anticorpo contra Dx selecionado mostrou boa especificidade, coeficiente de variação (CV por cento) intra e interensaio < 20 por cento, exatidão de 93,8 por cento e dose mínima detectada de 19,5 ng/dl. A concentração de Dx no soro foi semelhante nos voluntários e pacientes com SC (ausência/supressão do cortisol): 205 a 703 ng/dl e 174 a 661 ng/dl (intervalo de confiança [IC] 95 por cento), respectivamente; os valores foram indetectáveis naqueles que não se submeteram ao teste. DISCUSSÃO: O anticorpo empregado apresenta boa afinidade e especificidade para quantificar a Dx no soro. O RIE mostrou reprodutibilidade e eficiência na determinação dos níveis séricos de Dx durante o TSDx. CONCLUSÃO: O presente RIE para a dosagem de Dx no soro é acurado e confiável, permitindo estabelecer uma faixa de referência de valores para subsidiar a interpretação do TSDx.
INTRODUCTION: The 1 mg dexamethasone suppression test (DxST) is widely used to screen Cushing's syndrome (CS) due to its high diagnostic accuracy. CS is an endocrine-metabolic disorder caused by hypercorticism, which is characterized by the absence of cortisol suppression in DxST. OBJECTIVE: To develop a radioimmunoassay (RIA) for the measurement of serum dexamethasone (Dx) to complement DxST. METHODS: Three rabbits were inoculated with dexamethasone-21-hemisuccinate-BSA in order to choose the best antibody. Serum Dx RIA was performed according to RE 899/2003 (Agência Nacional de Vigilância Sanitária [ANVISA]) regulations. Serum samples from 96 volunteers from Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) and Santa Casa de Misericórdia de São Paulo were analyzed, 67 of which were submitted to DxST and 29 were not. There were 12 patients with CS. RESULTS: The Dx antibody chosen showed good specificity. Intra- and interassay CV were < 20 percent with 93.8 percent accuracy and the lowest detection limit was 19.5 ng/dl. Serum Dx concentration was similar among both volunteers and CS patients (absence of cortisol suppression): 205 to 703 ng/dl and 174 to 661 ng/dl (95 percent CI), respectively. Values were undetectable among those that were not submitted to the test. Discussion: The anti-Dx antibody shows high specificity and reliability to quantify serum Dx in DxST. The Dx RIA presented reproducibility and reliability in the determination of serum Dx levels during DxST. CONCLUSION: The current RIA for serum Dx is accurate and reliable, which permits to establish a reference value range to substantiate DxST interpretation.
Asunto(s)
Humanos , Animales , Conejos , Especificidad de Anticuerpos , Hidrocortisona/análisis , Radioinmunoensayo/métodos , Síndrome de Cushing/diagnósticoRESUMEN
A dosagem de testosterona sérica, total ou fração livre, é metodologia de alto valor diagnóstico e encontra-se disponível na maioria dos laboratórios clínicos. Esta disponibilidade foi possível pelo desenvolvimento de metodologias simples e diretas, adaptáveis a plataformas de dosagem automatizada. Uma série de publicações recentes tem alertado quanto às limitações destas metodologias, em especial em amostras com baixas concentrações, como mulheres e crianças. Neste trabalho serão apresentados os resultados do emprego de uma metodologia de referência, fundamentada em cromatografia líquida de alta performance e espectrometria de massa em tandem (HPLC/MS-MS), e sua comparação com uma dosagem de rotina (ensaio eletroquimioluminescente - ECLIA). Os métodos são comparados tanto na dosagem de testosterona total (n = 213) quanto na determinação de testosterona livre calculada com base na determinação da testosterona total e da proteína carregadora de hormônios sexuais (SHBG) (n = 135). Os valores obtidos com o ECLIA são significativamente mais elevados, sendo a dispersão mais nítida em soros com baixas concentrações. Tal fenômeno fica mais claro quando apresentado na forma de gráficos de Bland-Altman. Neste trabalho são discutidas as dificuldades de implementação de uma metodologia de referência, como a apresentada, e a convivência com as metodologias de rotina, bem como a literatura recente sobre o assunto.
Serum testosterone in its total or free form, is a highly valuable diagnostic test and is available in the great majority of clinical laboratories. This reality was possible due to the development of simple and direct assays, adaptable to large automatic systems. Recent publications have called attention to the limitations of these simplified methodologies, mainly in samples with low concentration, as women and children. In this paper we present results obtained using a reference method based on high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry (HPLC/MS-MS) and its comparison with those obtained with a commercial routine immunoassay (electrochemiluminescent assay, ECLIA). Methods were compared in total testosterone measurement (n = 213), as well as in free testosterone evaluation based on calculation inclu-ding sex hormone-binding protein (SHBG) levels (n = 135). Values obtained with ECLIA were significantly higher, with more marked dispersion in low concentration. This phenomenon is clearer when presented as a Bland-Altman plot. Difficulties in the implementation of reference methods as the one presented are discussed, as well as the necessity of caution in the interpretation of values obtained with routine assays, a matter of several publications in recent literature.
Asunto(s)
Adolescente , Adulto , Anciano , Niño , Femenino , Humanos , Masculino , Persona de Mediana Edad , Adulto Joven , Cromatografía Líquida de Alta Presión/métodos , Mediciones Luminiscentes , Espectrometría de Masas en Tándem/métodos , Testosterona/sangre , Interpretación Estadística de Datos , Electroquímica , Valores de Referencia , Sensibilidad y Especificidad , Globulina de Unión a Hormona Sexual/análisis , Adulto JovenRESUMEN
A dosagem de cortisol livre na urina (CLU) é um método útil na triagem de pacientes suspeitos de síndrome de Cushing. Os imunoensaios atuais apresentam limitacões que dificultam sua aplicacão e a comparacão de resultados por diferentes ensaios. No presente método para dosagem de cortisol e cortisona livres urinários, baseado em cromatografia líquida com deteccão por espectrômetro de massa em tandem (LC-MS/MS), uma alíquota de urina 24h (200æL) é misturada com solucão contendo quantidade conhecida de cortisol deuterado e extraída on-line em fase sólida (C18). O eluato é transferido para uma segunda coluna C18 (Phenomenex Luna, 3æ, de 50 x 2mm), e o eluato obtido em modo isocrático é aplicado diretamente no MS/MS modelo Quattro Micro, operando no modo positivo de ionizacão química a pressão atmosférica (APCI). Todo o processo é automatizado e a quantificacão é feita por diluicão isotópica com base nas razões das áreas dos picos dos analitos e do padrão interno deuterado. O estudo de especificidade mostrou que nenhum esteróide testado apresenta reatividade cruzada superior a 1 por cento com cortisol ou cortisona. A sensibilidade funcional é <1æg/L para os dois esteróides, e o CV interensaio <8 por cento. Os estudos de recuperacão e de linearidade foram satisfatórios, e a comparacão entre os resultados obtidos para cortisol em 98 amostras de rotina, pelo ensaio em estudo e por um RIE, mostraram correlacão de r= 0,838, sendo os valores obtidos por LC-MS/MS significativamente mais baixos (medianas de 22,0 e 49,4æg/24h, respectivamente) (P<0,0001). Os valores de referência para cortisol foram definidos entre 11 e 43æg/24h, compatíveis com métodos semelhantes recentemente descritos. A dosagem concomitante de cortisona livre urinária permite o estudo da atividade da enzima 11beta-HSD2 e a pesquisa da síndrome do excesso aparente de mineralocorticóides. O método descrito representa a primeira descricão, em nosso meio, de uma nova geracão de métodos para a medida de esteróides hormonais, baseados em processos preparativos automatizados e leitura por espectrometria de massa em tandem.
Asunto(s)
Humanos , Cromatografía Liquida/métodos , Cortisona/orina , Hidrocortisona/orina , Espectrometría de Masa por Ionización de Electrospray/métodos , Sensibilidad y EspecificidadRESUMEN
A dosagem dos esteróides hormonais tem apresentado evoluçäo técnica significativa, sendo' os principais esteróides de interesse clínico dosados, atualmente, por métodos simples, rápidos e automatizados. Existe, no entanto, um compromisso em detrimento da exatidäo, que é mais evidente na determinaçäo de esteróides de menor concentraçäo relativa e maior número de interferentes potenciais, como a 17-hidroxiprogesterona (170HP), a diidrotestosterona (DHT) e outros. Nestes casos, um processo preparativo versátil e robusto é fundamental para garantir resultados com alto grau de exatidäo. Apresentamos a padronizaçäo de um processo preparativo baseado em cromatografia líquida de alta performance (HPLC) comparado à cromatografia em coluna de celite para a dosagem de 170HP e DHT. Os anticorpos empregados nos respectivos radioimunoensaios apresentam especificidade semelhante aos descritos na literatura. As amostras foram inicialmente extraídas em éter etílico e em seguida submetidas ao processo cromatográfico. Amostras de soro provenientes da rotina foram dosadas em paralelo pelos dois métodos, sendo 57 amostras para 170HP e 84 para DHT. Näo houve diferença significativa entre os resultados, e os índices de correlaçäo foram elevados (R= 0,95 e 0,97). Os resultados comprovam que a aplicaçäo do HPLC é válida, além de ser mais reprodutível, versátil e menos operador-dependente. Sua aplicaçäo mais ampla permitirá uma melhora de exatidäo na dosagem de esteróides de baixa concentraçäo relativa, onde os métodos mais simples resultam em valores falsamente elevados.