Validación de la capacidad del proceso de pasteurización de la albúmina humana para inactivar virus / Validation of the capacity of the human albumin pasteurization process for virus inactivation

La validación de la capacidad de aclaramiento viral de los procesos de fabricación de productos biológicos constituye un requisito regulatorio en Cuba. Se recomienda introducir la pasteurización en los procesos de producción de la albúmina como un método capaz de inactivar virus; por ello, el objetivo del estudio fue validar la capacidad de inactivación viral de la etapa de pasteurización del proceso de producción de la albúmina humana al 20 y 25 por ciento. Los modelos virales que abarcan los posibles contaminantes de la materia prima, se diluyeron 1:10 en la albúmina en sus 2 concentraciones y se sometieron a tratamiento térmico a 60 °C durante 10 h. Se tomaron muestras a diferentes intervalos de tiempo para la confección de las curvas de cinética de inactivación. Se determinó el factor de reducción aportado por la pasteurización para cada virus. El tratamiento a 60 °C de la albúmina al 20 y 25 por ciento disminuyó significativamente la carga viral inicial con que se retó la etapa, con valores de p< 0,002 y p< 0,021, respectivamente, y se obtuvieron factores de reducción superiores a 4 log del título de todos los virus. La etapa de pasteurización le aportó a la albúmina humana al 20 y 25 por ciento un adecuado nivel de seguridad

The validation of the capacity of viral clearance in the manufacturing processes of biopharmaceuticals is a regulatory requirement in Cuba. It is recommended to introduce the pasteurization in the manufacturing processes of serum albumin as a method of inactivating viruses. The objective of this study was to validate the capacity of viral inactivation in the phase of pasteurization of the 20 percent and 25 percent human albumin production process The viral models covering the possible pollutants of the raw materials were diluted at 1:10 in albumin in 2 concentrations and they were heat-treated at 60 °C for 10 h. Several samples at different time intervals were taken to design the inactivation kinetic curves. The reduction factor of pasteurization for each virus was estimated. The treatment of 20 percent and 25 percent albumin at 60 °C decreased significantly the initial viral load in the stage, with p< 0.002 and p< 0.021 respectively. The reduction factors exceeded 4 log of the titers of all viruses. The stage of pasteurization gave adequate level of safety to the 20 percent and 25 percent human albumin

Caracterización de cepas cubanas de VIH-1 por ensayos biológicos y métodos bioinformáticos / Characterization of Cuban strains of HIV-1 by bioassays and bio-information methods

Mediante ensayos biológicos clásicos se ha podido determinar el uso del correceptor por las cepas de VIH-1, las cuales se han clasificado en R5, X4 o R5/X4, características que guardan relación con el fenotipo NIS o IS y con la evolución clínica. Por métodos bioinformáticos se han relacionado cambios aminoacídicos en la región del lazo V3 del env con el uso del correceptor. En este trabajo se presentan los resultados del estudio de caracterización de once cepas provenientes de individuos infectados con VIH-1, cinco de ellos seropositivos asintomáticos y seis progresores rápidos al SIDA. Se compararon los resultados del estudio fenotípico realizado por dos ensayos biológicos clásicos, uso de correceptores y capacidad de inducir sincicios en MT2 y tres métodos bioinformáticos, regla 11/25, matrices de puntos en posiciones específicas (PSSM) y el programa geno2pheno. Las cinco cepas de seropositivos asintomáticos coincidieron por todos los métodos como R5/NIS. Cinco de las seis cepas de progresores rápidos se clasificaron R5/X4 e IS por los ensayos biológicos; mientras dos clasificaron R5/X4 por Geno 2 Pheno, una por PSSM y todas fueron X4 puras por la regla 11/25. Los ensayos utilizados en el estudio permitieron caracterizar las cepas aisladas y relacionar el fenotipo con la evolución de la infección, por lo que valoramos que por ensayos biológicos o métodos bioinformáticas se pueden hacer estudios de caracterización, su utilidad está en dependencia del objetivo que se persiga

By the classic biological assays it has been possible to determine the use of HIV-1 strains co-receptor, which have been classified in R5, X4 or R5/X4, characteristic related to the NIS or IS phenotype and to the clinical course. By bio-information methods the amino acid changes in the region of V3 loop of the env using the co-receptor. In present paper are showed the results of a characterization study of eleven strains from HIV-1 infected subjects, five seropositive and six with a fast progression to AIDS. Authors compared the results of phenotype study conducted by two classic assays, use of co-receptors and ability to induce syncytia in MT2 and three bio-information methods, rule 11/25, point matrices in specific locations (PSSM) and the geno2pheno program. The five strains from asymptomatic seropositive patients coincided according all methods used as R5/NIS. Five of the six strains from fast progression patients were classified as R5/X4 and IS by biological assays; whereas two were classified as R5/X4 by Geno 2 Pheno, one by PSSM and all were pure X4 by the rule 11/25. The assays used in the study allowed us to characterize the isolated strains and to relate the phenotype to the infection course, thus, we considered that using biological assays or bio-information methods it is possible to conduct characterization studies, its usefulness depends on the pursued objectives

Validación del método de titulación del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 / Validation of the titration method for the human immunodeficiency virus type 1

INTRODUCCIÓN: en la validación de los procesos de producción de productos biológicos, la cuantificación viral es esencial para demostrar su seguridad. OBJETIVO: en este trabajo se evaluó el método de titulación del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1, para ello se determinó la exactitud, precisión, linealidad y límite de detección. MÉTODOS: la titulación se realizó por el método del cálculo de la dilución punto final, mediante la visualización del efecto citopático y la determinación de la producción de antígeno p24 por medio de un ensayo inmunoenzimático, la dosis infectiva media en cultivo de células por mililitro se calculó según el método de Reed y Muench. RESULTADOS: la exactitud del método coincidió con el título de referencia, los valores del coeficiente de variación de la precisión (repetibilidad y precisión intermedia) fueron menores que 5 y 10 por ciento, respectivamente; la linealidad mostró un adecuado coeficiente de correlación y el límite de detección se determinó en la dilución 10-12. CONCLUSIONES: el método evaluado demostró un adecuado desempeño para la cuantificación viral.

BACKGROUND: viral quantification is essential to demonstrate biological product safety during the validation of the production process. OBJECTIVE: to evaluate the accuracy, linearity and detection limit of a titration method for the human immunodeficiency virus type 1. METHODS: the titration was performed by calculating the end-point dilution method, through the cytopathic effect assay and the determination of Ag p24 production by an enzyme immunoassay. Mean infective dose in cultured cells per milimeter was estimated by Reed and Muench´s method. RESULTS: the accuracy of the method was similar to that of the reference titration, the variation coefficient figures for accuracy (repeatability and intermediate accuracy) were lower than 5 percent and 10 percent, respectively, the linearity showed adequate correlation coefficient and the detection limit was determined in the 10-12 dilution CONCLUSIONS: the evaluated method was suitable for viral quantification.

Inhibición de la replicación del virus de inmunodeficiencia humana por extractos de taninos de Pinus caribaea Morelet / Inhibition of human immunodeficiency virus replication by tannin fractions of Pinus caribaea Morelet

Diferentes concentraciones de 6 extractos de corteza de Pinus caribaea Morelet var. caribaea se enfrentaron a 2 dosis de virus en un ensayo in vitro, sobre células MT4; la actividad antiviral se midió por ensayo inmunoenzimático de captura de proteína 24 del virus. Todas las fracciones mostraron actividad citotóxica moderada y solo una fue altamente tóxica. La fracción 02 mostró un alto porcentaje de inhibición de la replicación viral, en relación con la dosis viral y la concentración del producto, con un índice de selectividad de 100, pero son necesarios estudios adicionales sobre la identificación de la estructura química para definir el mecanismo de acción del producto

Inactivacion de virus ADN envueltos en la producción de hemoderivados (Albúmina e Inmunoglobulinas) / Inactivation of enveloped DNA virus in the production of hemoderivatives (albumin and immunoglobulins)

Se estudió la inactivación del virus herpes simple humano tipo 1 como modelo de virus ADN envueltos, durante las etapas de producción de las inmunoglobulinas intramuscular e intravenosa y la albúmina humana, las etapas del método de fraccionamiento alcohólico para la obtención de estos productos, así como los métodos de remoción y/o inactivación introducidos en el proceso de manufactura, pasteurización y cromatografía de intercambio iónico. El virus se cuantificó por efecto citopático. La obtención de valores de reducción acumulativos reportados en este trabajo demuestran que el método de fraccionamiento alcohólico utilizado en Cuba como variante del método de Cohn-Oncley, combinando métodos de inactivación/remoción, produce un nivel de inactivación de virus ADN envueltos que garantiza una alta seguridad biológica de estos productos para su uso en humanos

Seroprevalencia de la infección por HTLV-I en diferentes grupos de riesgo estudiados en Cuba / Infection HTLV-I seroprevalence in risks groups in Cuba

Se estudiaron, en el período comprendido desde 1991 hasta 1996, 26 352 muestras de suero procedentes de diferentes grupos de riesgo y donantes de sangre para conocer la seroprevalencia de anticuerpos contra el virus linfotrópico de las células T humanas tipo I (HTLV-I) y como continuación de investigaciones realizadas entre 1989 y 1990. Se empleó el sistema de ELISA DAVIH-HTLV-I para el pesquisaje de anticuerpos y como prueba confirmatoria, el Western Blot DAVIH-Blot HTLV-I, ambos de Laboratorios DAVIH, Cuba. Se confirmó la presencia de anticuerpos anti HTLV-I en 10 personas y en la mayoría de ellas el estudio epidemiológico logró esclarecer la vía probable de contagio. El índice de seropositividad observado fue de 0,037 porciento, lo que en comparación con las tasas de seroprevalencia reportadas para el área del Caribe resulta bajo.

Caracterización biológica de aislamientos de VIH-1 en pacientes con una evolución clínica rápida

Se estudiaron las características biológicas de 11 cepas de VIH-1 aisladas de pacientes con rápida evolución clínica al sida. Los aislados virales se clasificaron según su cinética de replicación y tropimo celular, con estos criterios se observó que 8 de las cepas aisladas (72,7 %) resultaron de crecimiento rápido alto o lento bajo 3 y con tropismo preferencial a la estirpe linfocítica, como corresponde a los pacientes con sida, mientras 3 (27,3 %) tuvieron características de lenta baja 1. La citopatogenicidad de las cepas se estudió en la línea celular MT4 y se observó que la mayoría (72,7 %) resultó inductora de sincicios (IS), por lo que se comprobó relación in vivo e in vitro de las propiedades biológicas, no ocurrió así en 3 de los cultivos (27,3 %) que se comportaron como no inductores de sincicios.

The biological characteristics of 11 HIV-1 strains isolated from patients with a fast clinical evolution to AIDS were studied. The viral isolates were classified according to their replication kinetics and cell tropism. Taking into account these criteria, it was observed that 8 of the isolated strains (72,7 %) were of rapid high growth (RH) or slow low 3 (SL3) with preferential tropism to the lymphocytic stock, as it corresponds to AIDS patients. 3 (27,3 %) had characteristics of slow low 1 (SL1). The cytopatogenecity of the strains was studied in the MT4 celular line, and it was observed that most of them (72,7 %) were syncytium-inducing strains (SI), which allowed to prove the in vivo and in vitro relation of the biological properties. It was not so in 3 of the cultures (27,3 %) that behaved as non-syncytium inducers.

Evaluación del sistema DAVIH-Blot TLV-I para la confirmación de anticuerpos al HTLV-I/II / Evaluation of the DAVIH-BLOT HTLV-I system for the confirmation of HTLV-I/II antibodies

El sistema DAVIH-HTLV-I del Laboratorio DAVIH (La Habana, Cuba) para la confirmación del diagnóstico serológico de anticuerpos contra el HTLV-I/II se evaluó frente a 223 sueros de individuos que representan diferentes grupos de riesgo, de ellos 47 confirmados seropositivos al HTLV-I, 86 muestras tomadas de pobladores de áreas endémicas, 52 de donantes de sangre, 16 de seropositivos al VIH-1, 16 de pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) con anticuerpos anti-DNA y 6 con anticuerpos contra antígenos HLA clases I y II. Se cumplieron los criterios de confirmación como positivos en 46 de las 47 muestras y una resultó indeterminada. Entre los pobladores de áreas endémicas se encontró el 18,6 porciento de muestras positivas y el 19,7 porciento de indeterminadas, con una alta frecuencia de reactividad frente a la p24. En los donantes de sangre ninguna muestra fue positiva y el 5,77 porciento de indeterminados, con reactividad frente a la p19 y p24. En el resto de las muestras no hubo casos positivos ni indeterminados. Además, se comparó este sistema confirmatorio con el sistema HTLV-I Western blot de la firma Diagnostic Biotechnology (Singapur) y se obtuvo una concordancia del 95,6 porciento

Detección de Proteína P24 del VIH-1 por 2 sistemas de ELISA de captura de antígeno / Detection of HIV-1 protein (p24) by two antigen capture ELISA systems

En este trabajo se comparó un análisis inmunoenzimático (AIE) desarrollado en nuestro laboratorio para la detección del antígeno p24 del VIH en sobrenadantes de cultivo, con el sistema Vironostika (Organon Teknika). Se evaluaron 56 muestras de aislamiento de linfocitos y cocultivos y se determinó la concordancia entre ambos sistemas para diferentes rangos de concentración. Los datos obtenidos se procesaron estadísticamente mediante la posibilidad exacta de Fisher para comprobar 2 porcentajes y se observaron diferencias estadísticamente significativas en el rango de 10-19,9 pg/mL (p =0,04118) y 5-9,9 pg/mL (p = 0,00758), por lo que se concluyó que nuestro sistema de detección de antígeno p24 DAVIH-p24 presenta menor sensibilidad analítica que el sistema Vironostika

Empleo de la técnica de inmunoperoxidasa en la detección de gp41 en cultivos celulares infectados con VIH-1 / Use of the immunoperoxidase technique for detecting gp41 in cellular cultures infected with HIV-1

Las glicoproteínas de envoltura gp120 y gp41 del VIH-1 son responsables de la interacción con las células CD-4+ y permiten la penetración del virus en éstas, además de otras funciones. El monitoreo del estado infectivo de los cultivos celulares mediante la determinación de gp41 en las células por la técnica de inmunoperoxidasa, es el objetivo final de la normalización de la técnica reportada en nuestro trabajo. Se utilizaron cultivos de celúlas CEM-VIH-1 y células CEM sin infectar como control negativo. La reacción se llevó a cabo mediante el uso de un anticuerpo monoclonal anti-gp41 y se utilizó un conjungado anti IgG de ratón marcado con peroxidasa para revelar la reacción. Los resultados mostraron la posibilidad del uso de esta técnica para el monitoreo de los cultivos celulares utilizados en la producción viral