Análise TG-ROC de testes de imunofluorescência no diagnóstico de leishmaniose visceral canina / TG-ROC analysis of immunofluorescence assays in canine visceral leishmaniasis diagnosis

OBJETIVO: Analisar a acurácia do diagnóstico de dois protocolos de imunofluorescência indireta para leishmaniose visceral canina. MÉTODOS: Cães provenientes de inquérito soroepidemiológico realizado em área endêmica nos municípios de Araçatuba e de Andradina, na região noroeste do estado de São Paulo, em 2003, e área não endêmica da região metropolitana de São Paulo, foram utilizados para avaliar comparativamente dois protocolos da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para leishmaniose: um utilizando antígeno heterólogo Leishmania major (RIFI-BM) e outro utilizando antígeno homólogo Leishmania chagasi (RIFI-CH). Para estimar acurácia utilizou-se a análise two-graph receiver operating characteristic (TG-ROC). A análise TG-ROC comparou as leituras da diluição 1:20 do antígeno homólogo (RIFI-CH), consideradas como teste referência, com as diluições da RIFI-BM (antígeno heterólogo). RESULTADOS: A diluição 1:20 do teste RIFI-CH apresentou o melhor coeficiente de contingência (0,755) e a maior força de associação entre as duas variáveis estudadas (qui-quadrado=124,3), sendo considerada a diluição-referência do teste nas comparações com as diferentes diluições do teste RIFI-BM. Os melhores resultados do RIFI-BM foram obtidos na diluição 1:40, com melhor coeficiente de contingência (0,680) e maior força de associação (qui-quadrado=80,8). Com a mudança do ponto de corte sugerido nesta análise para a diluição 1:40 da RIFI-BM, o valor do parâmetro especificidade aumentou de 57,5 por cento para 97,7 por cento, embora a diluição 1:80 tivesse apresentado a melhor estimativa para sensibilidade (80,2 por cento) com o novo ponto de corte. CONCLUSÕES: A análise TG-ROC pode fornecer importantes informações sobre os testes de diagnósticos, além de apresentar sugestões sobre pontos de cortes que podem melhorar as estimativas de sensibilidade e especificidade do teste, e avaliá-los a luz do melhor custo-benefício.

OBJECTIVE: To analyze the accuracy of the diagnosis of two protocols of indirect immunofluorescence assays for canine visceral leishmaniasis. METHODS: Dogs from the seroepidemiological survey conducted in an endemic area of the cities of Araçatuba and Andradina, in Northwestern São Paulo state, in 2003, and in a non-endemic area of the metropolitan region of São Paulo, were used to assess two protocols of indirect immunofluorescence assay (IFA) for leishmaniasis: one using a Leishmania major heterologous antigen (IFA-BM) and another using a Leishmania chagasi homologous antigen (IFA-CH). Two-graph receiver operating characteristic (TG-ROC) analysis was used to estimate accuracy. TG-ROC analysis compared 1:20 dilution readings of the homologous antigen (IFA-CH), considered as reference test, with IFA-BM dilutions (heterologous antigen). RESULTS: The 1:20 dilution used in the IFA-CH test showed the best contingency coefficient (0.755) and the highest strength of association between the two variables studied (chi-square=124.3). Thus, it was considered the test reference dilution in comparisons with different IFA-BM test dilutions. The best IFA-BM results were obtained from 1:40 dilutions with the best contingency coefficient (0.680) and highest strength of association (chi-square=80.8). With the change in the cut-off point, recommended for the IFA-BM 1:40 dilution in this analysis, the specificity parameter value rose from 57.5 percent to 97.7 percent, even though the 1:80 dilution showed the best sensitivity estimate (80.2 percent), with the new cut-off point. CONCLUSIONS: TG-ROC analysis can provide important information about diagnostic tests, in addition to offering suggestions on cut-off points that can improve test sensitivity and specificity estimates and assessing these tests in terms of the best cost-benefit ratio.

A comparison of the immune parameters of dogs infected with visceral leishmaniasis using Western blot and neutralization techniques

The Western blot technique was used to demonstrate the presence of antibodies in the blood of dogs that presented canine visceral leishmaniasis. This technique was used against some specific molecules present in the lysate of the promastigote form of Leshmania chagasi.Through the association of the results of the Western blot technique with the morphological alterations seen as a result of the serum neutralization technique performed in McCoy cells (which mimetizes the macrophage) it was possible to observe the role of some molecules of great relevance in determining the disease in symptomatic dogs as well as that of some other molecules associated with asymptomatic infected dogs that may become transmitters as well as differentiating them as asymptomatic resistant dogs. In the sera analyses carried out during the immunobloting a variation of 9 to 27 immunoreacting bands was observed, which were then compared using Dice's similarity coefficient. In the dendrogram constructed on the basis of the coefficient, 50 percent similarity was observed among the total number of reagent bands with the promastigote lysate, thus creating five groups. The main difference observed related to the clinical condition of the dogs: symptomatic and asymptomatic dogs were found in separate groups. The asymptomatic group of dogs was distributed in two different places in the dendrogram because they presented two different behavior patterns regarding the cellular morphology in the serum neutralization reaction: the presence or absence of cellular lysis. According to this analysis it is possible to evaluate the immune status and associate it with specific markers observed in the reaction found in the Western blot strips.

A técnica de Western blot foi utilizada para demonstrar a presença de anticorpos do soro de cães, que apresentavam leishmaniose visceral canina, contra algumas moléculas específicas no lisado da forma promastigota de Leshmania chagasi.Através da associação da técnica de Western blot com as alterações morfológicas observadas como resultado da técnica de soro-neutralização em células McCoy (que mimetizam o macrófago) foi possível observar o papel de algumas moléculas de maior relevância para a determinação da doença em cães sintomáticos bem como o papel de outras moléculas na predição de cães infectados assintomáticos com o potencial de serem transmissores e ainda diferenciá-los como cães assintomáticos resistentes. Na análise dos soros durante a reação de immunoblotting observou-se uma variação de 9 a 27 bandas imunorreagentes, que foram comparadas utilizando-se o coeficiente de similaridade de Dice. No dendrograma construído com base no coeficiente, observou-se 50 por cento de similaridade entre as bandas totais reagentes com o lisado de promastigota formando cinco agrupamentos. A principal diferença foi observada com respeito à condição clínica, ou seja, cães sintomáticos e assintomáticos ficaram em grupos separados. Os soros dos cães assintomáticos distribuídos em dois grupos diferentes do dendrograma apresentaram padrões de comportamento diferentes, quanto à morfologia celular na reação de soro-neutralização, ou seja, a presença ou ausência de lise celular. De acordo com esta análise foi possível avaliar o status imunitário e associá-lo com determinados marcadores específicos observados na reação encontrada nas fitas de Western blot.

Kinetics of growth of Leishmania (Leishmania) chagasi cycle in McCoy cell culture

The kinetics of growth of Leishmania performed in vitro after internalization of the promastigote form in the cell and the occurrence of the transformation of the parasite into the amastigote form have been described by several authors. They used explants of macrophages in hamster spleen cell culture or in a human macrophage lineage cell, the U937. Using microscopy, the description of morphologic inter-relationship and the analysis of the production of specific molecules, it has been possible to define some of the peculiarities of the biology of the parasite. The present study shows the growth cycle of Leishmania chagasi during the observation of kinetic analysis undertaken with a McCoy cell lineage that lasted for a period of 144 hours. During the process, the morphologic transformation was revealed by indirect immunofluorescence (IF) and the molecules liberated in the extra cellular medium were observed by SDS-PAGE at 24-hour intervals during the whole 144-hour period. It was observed that in the first 72 hours the promastigote form of L. chagasi adhered to the cell membranes and assumed a rounded (amastigote-like) form. At 96 hours the infected cells showed morphologic alterations; at 120 hours the cells had liberated soluble fluorescent antigens into the extra cellular medium. At 144 hours, new elongated forms of the parasites, similar to promastigotes, were observed. In the SDS-PAGE, specific molecular weight proteins were observed at each point of the kinetic analysis showing that the McCoy cell imitates the macrophage and may be considered a useful model for the study of the infection of the Leishmania/cell binomial.

Cinéticas de crescimento de Leishmania realizadas in vitro após a internalização da forma promastigota na célula e a ocorrência da transformação do parasito na forma amastigota foram descritas por vários autores, seja com a utilização de explantes de macrófagos em células de baço de hamster ou atualmente da célula de linhagem de macrófago humano U937. Aliando a microscopia à descrição das inter-relações morfológicas e à síntese de moléculas específicas foi possível esclarecer pontos sobre a biologia do parasito. O presente estudo mostra o acompanhamento do ciclo de crescimento da Leishmania chagasi em uma cinética realizada com células de linhagem McCoy, no período de 144 horas. Durante o processo, as transformações morfológicas foram reveladas pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e as moléculas liberadas no meio extracelular foram observadas pelo método de SDS-PAGE, em intervalos de 24 horas no período de 144 horas. Observou-se que nas primeiras 72 horas, a forma promastigota da L. chagasi fica aderida à membrana das células com aspecto arredondado (amastigota-like). Em 96 horas as células infectadas apresentaram alterações morfológicas; em 120 horas, as células liberaram, para o meio extracelular, antígenos fluorescentes solúveis; e em 144 horas foram observadas novas formas alongadas dos parasitos como se fossem promastigotas. No SDS-PAGE, proteínas com pesos moleculares específicos são observadas em cada ponto da cinética, mostrando que a célula McCoy parece mimetizar o macrófago e que pode ser um modelo útil para o estudo da infecção do binômio leishmânia/célula.

Reproduction of Leishmania (Leishmania ) infantum chagasi in conditioned cell culture growth medium

Leishmânias podem ser produzidas em meio de crescimento condicionado, após o cultivo de células McCoy (MCC). Promastigotas crescidas em meio semi-sólido NNN foram inoculadas em MCC, inicialmente, 100 parasitos por poço com 2,5 mL de McCoyMCC, em placas com 24 poços, sua multiplicação foi observada por uma cinética de 120 horas. Após este tempo, o meio estava saturado de promastigotas. A reprodução das leishmânias foi acompanhada a cada 24 horas, com contagem do número de parasitos por campo fotomicrografado. Como vantagem da técnica do crescimento da leishmânia em MCC tem-se o seu baixo custo, com pequena quantidade de parasitos pode-se obter o aumento da densidade de promastigotas em tempo reduzido. Com o emprego dessa técnica pode-se estudar o comportamento e a multiplicação das leishmânias nos vertebrados e invertebrados, assim como, obter antígenos, tanto brutos (leishmânia) como solúveis, produzidos pelos parasitos, que poderão ser úteis para se desenvolver kits de diagnósticos.

Estimativa de validade de um novo método de isolamento de vírus rábico / Estimate of the validity of a new method for the isolation of rabies virus

OBJETIVOS: Nenhum estudo de base populacional foi realizado para mostrar o uso potencial de diagnóstico virológico do vírus rábico. O estudo realizado teve por objetivo estimar parâmetros de acurácia para o isolamento de vírus rábico em célula McCoy, como um método alternativo, e comparar com o uso da célula N2A, considerada método de referência. MÉTODOS: Foi realizado um inquérito em 120 morcegos coletados aleatoriamente, na Mata Atlântica, no Estado de São Paulo. Utilizou-se a reação de imunofluorescência para a detecção do vírus rábico isolado no cérebro desses morcegos, avaliado nos dois sistemas de cultivos celulares. Dois bancos de dados foram formados com os resultados. A análise foi feita com o programa Computer Methods for Diagnosis Tests (CMDT), utilizando a técnica de two-graph-receiver operating characteristic (TG-ROC) para obter os parâmetros de sensibilidade e especificidade, além de outros indicadores, tais como eficácia, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e razão de verossimilhança. RESULTADOS: A célula N2A apresentou 90 por cento de sensibilidade e especificidade, enquanto que a célula McCoy obteve 95 por cento para os mesmos parâmetros. Os valores foram baseados em pontos de cortes otimizados para cada uma das células. CONCLUSÕES: Observou-se que a célula McCoy permite obter estimativas de acurácia superiores aos resultados observados com a célula de N2A, representando um método alternativo eficaz no isolamento do vírus rábico.

McCoy cell line as a possible model containing CD4+ receptors for the study of HIV-1 replication

Several studies have recently shown the use of recombinant rabies virus as potential vector-viral vaccine for HIV-1. The sequence homology between gp 120 and rabies virus glycoprotein has been reported. The McCoy cell line has therefore been used to show CD4+ or CD4+ like receptors. Samples of HIV-1 were isolated, when plasma of HIV-1 positive patients was inoculated in the McCoy cell line. The virus infection was then studied during successive virus passages. The proteins released in the extra cellular medium were checked for protein activity, by exposure to SDS Electrophoresis and blotting to nitro-cellulose filter, then reacting with sera of HIV positive and negative patients. Successive passages were performed, and showed viral replication, membrane permeabilization, the syncytium formation, and the cellular lysis (cytopathic effect). Flow cytometry analysis shows clear evidence that CD4+ receptors are present in this cell line, which enhances the likelihood of easy isolation and replication of HIV. The results observed allow the use of this cell line as a possible model for isolating HIV, as well as for carrying out studies of the dynamics of viral infection in several situations, including exposure to drugs in pharmacological studies, and possibly studies and analyses of the immune response in vaccine therapies

Evaluation of the performance of the modified direct agglutination test (MAT) for detection of Toxoplasma gondii antibodies in dogs

Toxoplasmose é uma zoonose que vem sendo objeto de estudos no Brasil e em todas as partes do mundo. Os cães são considerados sentinelas da infecção, podendo carrear o agente pelo ambiente. Levantamentos soro-epidemiológicos desses animais são importantes ferramentas de vigilância e controle da doença em programas de saúde. Neste estudo a performance do Teste de Aglutinação Modificada (MAT) no sorodiagnóstico da toxoplasmose canina foi avaliado e comparado à reação de imunoflorescência indireta (RIFI). Uma amostra de 157 soros de cães do município de Monte Negro, Rondônia, com 76.40 por cento de animais positivos ao Toxoplasma gondii (RIFI =16) foi analisado utilizando o MAT (=25) e apresentou sensibilidade de 85,00 por cento (Intervalo de Confiança 95,00 por cento: 79,4-90,60 por cento) e especificidade de 100,00 por cento.

Validaçäo de um novo método de isolamento de vírus rábico: prevalência do vírus rábico em morcegos albergados no Parque Estadual Intervales, Estado de Säo Paulo; estudo comparativo entre duas metodologias / Validation of a new rabies virus isolation method

O estudo de validaçäo foi realizado com uma amostra aleatória de morcegos capturados na Mata Atlântica, avaliada quanto à presença do vírus rábido por dois sistemas de cultivos celulares para o isolamento do vírus, cujos os resultados foram comparados por meio de algumas medidas indicadoras. Os indicadores para estimar a validade do novo método foram: sensibilidade, especialidade, valores preditivos positivo e negativo, e acurácia. As estimativas foram comparadas pelos seguintes métodos: Receiving Operacional Characteristics (ROC); análise gráfica exploratória pela técnica de Bland & Altman, para verificar algum viés; e técnica de Passing-Bablok, para estabelecer a linearidade entre os dois métodos e determinar o valor de nível de corte para o teste de diagnóstico, e a probabilidade de a regiäo ser uma área livre da doença ou näo. Nas duas linhagens celulares, io isolamento do vírus rábico apresentou proporçöes diferentes (6,6 por cento e 15,12 por cento). O método alternativo (célula McCoy) apresentou valores de sensibilidade e de especificidade iguais a 100 por cento, enquanto que o método de referência apresentou valores de 5,9 por cento para sensibilidade, e de 94 por cento para especificidade, quando confrontados na análise computacional pelas curvas ROC. Porém, quando avaliados individualmente, o método de referência apresentou superioridade numérica, com valores de 25 por cento para sensibilidade, e de 71,4 por cento para especificidade, enquanto que o método alternativo teve valores de 16,6 por cento e de 75,2 por cento, para sensibilidade e especicifidade, respectivamente. O estudo demonstrou correlaçäo entre ambos os médicos para o isolamento do vírus rábico. No entretanto, o teste de hipótese - aplicado para verificar a endemicidade da regiäo - mostrou que o método alternativo (célula McCoy) foi mais eficaz para discriminar a presença do vírus rábico, bem como para estabelecer a possibilidade de a regiäo näo estar livre de doença

Adverse effect versus quality control of the Fuenzalida-Palacios antirabies vaccine

Avaliamos os componentes da vacina anti-rabica tipo Fuenzalida-Palacios que e ainda utilizada na maioria dos paises em desenvolvimento na imunizacao humana para o tratamento profilatico. Essa vacina e feita em cerebros de camundongos neonatos diluida a 1 por cento, apesar de ser considerada uma vacina com pouco teor de mielina, no entanto ela nao e totalmente livre de mielina, bem como de outros componentes indesejaveis que podem desencadear efeitos adversos a vacinacao, o efeito mais grave esta relacionado com o acidente neuroparalitico pos vacinal associado a sindrome de Guillain Barre. Neste trabalho demonstramos como as vacinas produzidas e distribuidas pelos diversos laboratorios produtores apresentam padroes diferentes de seus componentes com diversos graus de impurezas e com concentracoes proteicas tambem variadas, demonstrando que os processos de producao podem variar em cada laboratorio e que essas diferencas que poderiam ser controladas por meio de um melhor controle de qualidade podem afetar e comprometer a imunizacao acarretando em riscos e efeitos adversos apos a utilizacao dessas vacinas

Morphometric analysis of McCoy cells inoculated with cerebrospinal fluid from patients with rabies

To demonstrate the potential of McCoy cells for the isolation of rabies virus from the cerebrospinal (CSF) fluid of a patient with a diagnosis of rabies, McCoy cells were inoculated with CSF from a patient with a clinical diagnosis of rabies and investigated in terms of morphometric aspect using the JAVA analysis system for the quantification of the increased size of infected cells compared to noninfected cells. The cells were also examined in terms of specific staining for the diagnosis of rabies by the method of Sellers for the observation of intracytoplasmic inclusions and by specific immunofluorescence staining for rabies virus. Infected cells showed changes in cell permeability and morphologic modifications which differed significantly compared to normal cells (p<0.001) when analysed by the Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests. Intense activity of the endoplasmic reticulum was also observed, as indicated by the presence of intracytoplasmic inclusions visualized by specific staining. The present study demonstrated the isolation of rabies virus from the CSF of a patient with rabies, showing that McCoy cells can be used for the laboratory diagnosis of patients suspected to have rabies.

Rabies virus in McCoy cell line. Part I - cytophatic effect and replication

The cytopathic effect caused by rabies virus is not easy to detect, although the McCoy cell line showed high sensitivity to this virus. The titre increased at each new passage and the ERA strain reached titre higher than 10(8.0)LD50/0,03ml after eight successive passages only. The kinetics of infection showed that 48 hours after inoculation, the cell reaches the peak of infecton and the celular proteins synthesis is inhibited. The data are reproducible suggesting that this cell line could be used for diagnostic purposes and for virus mass production

Rabies virus in McCoy cell line: Part II - titration

The McCoy cell line has showed high sensivity to rabies virus. This cell line presents cythopatic effect (CPE), when infected with rabies virus. Three strains of rabies virus were tested: CVS, ERA, and PVI and three street virus were isolated: one from a patient bitten by bat, other from a rabid dog and another from bovine. This cell line was used for virus titration purposes due to the presence of cytophatic effect, two techniques for observation of the CPE were used and were compared to the classical method of intracerebral inoculation in mice