RESUMEN
La búsqueda de fuentes nutricionales alternativas, para el cultivo masivo de microorganismos, ha sido una práctica común en el área de la microbiología industrial. Sin embargo, no en todos los casos es factible hacer estas sustituciones, ya que la presencia o ausencia de ciertos nutrientes puede condicionar el crecimiento celular, así como la expresión de algunos metabolitos. En la presente investigación se formularon una serie de medios a base de hidrolizado de caseína y extracto del micelio de Aspergillus niger, para sustituir los componentes del medio Luria-Bertani (LB) en el cultivo de una cepa de Escherichia coli mejorada genéticamente. Se evaluó la calidad de los medios siguiendo el crecimiento bacteriano, comparando los parámetros cinéticos y analizando el perfil electroforético de las proteínas y ácidos nucléicos celulares totales, recuperados de los paquetes celulares al final de los cultivos. Se encontró que el medio formulado con 75% de hidrolizado de caseína y 75% de extracto del hongo, favorece el crecimiento celular y la expresión genética de igual manera que el medio LB. El perfil de proteínas celulares varía significativamente si se utiliza una proporción menor, indicando un límite en la reducción de componentes nutritivos del medio alternativo.
The search for alternative nutritional sources for mass microorganism cultures has been a common practice in the area of industrial microbiology. Nevertheless, it not possible to use these substitutes in all cases since the presence or absence of certain nutrients can condition cellular growth, as well as the expression of certain metabolites. In the present investigation several media were formulated based on casein hidrolyzate and Aspergillus niger mycelium extract to substitute the components of Luria-Bertani (LB) medium, for culturing a genetically improved Escherichia coli strain. The quality of the media was evaluated by following bacterial growth, comparing the kinetic parameters and analyzing the protein electrophoretic profile and total cell nucleic acids recovered from the cell packages of final cultures. It was found that the medium formulated with 75% casein hidrolyzate and 75% fungus extract favors cell growth and genetic expression in a similar fashion to LB medium. The cell protein profile varies significantly if a smaller proportion is used, indicating a limit in the reduction of nutritive components of the alternative medium.
RESUMEN
La enzima glucosa oxidasa (GOX) es componente esencial de reactivos para determinación de glicemia y otros parámetros paraclínicos. Para su producción suele utilizarse Aspergillus niger cultivado en medios con sustratos costosos de grado analítico. Por tanto, se planteó purificar GOX producida por A. niger, cultivado con nutrientes complejos y económicos, y evaluar su efectividad en mediciones de concentración de glucosa. Para ello se formularon 4 tipos de medio, uno estándar y tres alternativos con azúcar industrial y fertilizantes. Los cultivos se realizaron en fiolas con 50 mL de medio bajo un diseño de bloques al azar, evaluando el crecimiento y la actividad enzimática. El medio alternativo con mejor rendimiento fue seleccionado para producción en biorreactores de 5 L y posterior purificación de GOX (fraccionamiento salino y cromatografías en Sephadex G-25 y DEAE-Sephacel). Se obtuvieron altos rendimientos de enzima (7 mg por carga) de alta pureza (39000 U/g) y un K M aparente para glucosa de 22 ± 1 mM. El reactivo de diagnóstico formulado presentó un intervalo de linealidad óptima (de 50 a 600 mg/dL de glucosa). Por lo que se concluyó que los sustratos en el medio de cultivo alternativo no interfieren en la calidad y cantidad del producto purificado.
The enzyme glucose oxidase (GOX) is an essential component of reagents used for determining blood sugar and other clinical parameters. Aspergillus niger grown in media prepared with expensive analytical grade substrates is used for its production. Therefore, we decided to purify GOX produced by A. niger grown in media with complex and inexpensive nutrients and to evaluate its efficiency in glucose concentration measurement assays. For this purpose we formulated four types of media, one standard and other three alternatives in which we used industrial sugar and fertilizers. The cultures were done in 50 mL flasks under a random block design, evaluating growth and enzymatic activity. The alternative medium with the best yield was selected for production in 5 liter bioreactors and later GOX purification (saline fractioning and Sephadex G-25 and DEAE-Sephacel chromatography ). Two large enzyme yields were obtained (7 mg per load), highly purified (39000 U/g), and with an apparent 22 ± 1 mM glucose K M. The diagnostic reagent formulated presented an optimal linearity interval (between 50 and 60 mg/dL glucose). Therefore, it was concluded that the substrates in the alternative culture medium did not interfere in the quality and quantity of the purified product.