Criopreservación de espermatozoides de canino con extracto de hojas de arándano (Vaccinium corymbosum L. ) / Cryopreservation of canine spermatozoa with blueberry leaf extract (Vaccinium corymbosum L. )

La criopreservación espermática induce daño por estrés oxidativo en las células, lo que conlleva a un deterioro de la calidad del semen descongelado. Los espermatozoides pueden ser protegidos de este daño, por la adición de antioxidantes al medio de congelación. El objetivo de este estudio fue determinar el efecto de la adición de extracto de hojas de arándano (EHA) al medio de congelación, sobre la calidad de espermatozoides de canino criopreservados. Espermatozoides desprovistos del plasma seminal fueron congelados con diferentes concentraciones de EHA (0 %, control; 1 %, EHA1; 2 %, EHA2; 4 %, EHA4 y 6 %, EHA6) adicionadas al medio de congelación. Post descongelación se evalúo la motilidad progresiva; la viabilidad e integridad de la membrana plasmática (SYBR-14/PI) e integridad de la membrana acrosomal (FITC-PNA/PI) por citometría de flujo. La motilidad progresiva fue similar al control con las concentraciones de EHA1y EHA4 (P >0,05), mientras que con las concentraciones de EHA2 y EHA6 se observó una disminución significativa de este parámetro comparado con el control (P <0,01 y P <0,001 respectivamente). La adición de EHA1, EHA2 y EHA4 al medio de congelación no presentó diferencias significativas respecto al control sobre la viabilidad e integridad de la membrana plasmática (P >0,05); por el contrario, con la adición de EHA6 se observaron valores significativamente menores (P <0,001). Los valores de integridad de la membrana acrosomal, con las diferentes concentraciones de EHA no presentaron diferencias significativas respecto al control. En conclusión, los resultados obtenidos en este estudio revelaron que las concentraciones de EHA utilizadas no fueron eficaces en mejorar la calidad del semen canino descongelado.

During cryopreservation, oxidative stress damage leads to a deterioration of the quality of thawed semen, which could be reduced by the addition of antioxidants to freezing extender. This study was designed to determine the effect of the addition of blueberry leaf extract (EHA) to freezing extender, on quality of cryopreserved canine sperms. Sperm devoid from seminal plasma were frozen with different concentrations of EHA (0 %, control; 1 %, EHA1; 2 %, EHA2; 4 %, EHA4 y 6 %, EHA6) added to freezing extender. Post-thawing progressive motility was evaluated; the viability and plasma membrane integrity (SYBR-14/PI) and acrosomal membrane integrity (FITC-PNA/PI) were assessed by flow cytometry. Progressive motility was similar to the control with concentrations of EHA1 and EHA4 (P >0.05); at concentrations of EHA2 and EHA6 a significant decrease of this parameter compared to control (P <0.01and P <0.001, respectively) was observed. The addition of EHA1, EHA2 and EHA4 to the freezing extender showed no significant differences with respect to the control on viability and plasma membrane integrity (P >0.05); however with the addition of EHA6 values significantly lower (P <0.001) were exhibited. The concentrations of EHA used showed no significant differences with respect to the control on acrosome membrane integrity. In conclusion, the results of this study revealed that none of the concentrations of EHA used were effective in improving canine thawed semen quality.

Validación de sybr-14 y 6-cfda para evaluar la viabilidad e integridad de la membrana plasmática en espermatozoides caninos de raza chihuahua / Validation of sybr-14 and 6-cfda to evaluate the viability and plasma membrane integrity in sperm of chihuahua canine breed

En la aplicación de técnicas reproductivas es importante determinar in vitro la capacidad fecundante de los espermatozoides, para ello se utilizan combinaciones de tinciones para evaluar los diferentes parámetros de función espermática, aumentando así la precisión de la estimación de la muestra. El objetivo del estudio fue comparar la efectividad de la utilización de los fluorocromos 6-CFDA y SYBR-14 combinados con PI para determinar la viabilidad e integridad de la membrana plasmática por citometría de flujo. Se utilizó semen fresco de caninos (n=5) de raza Chihuahua, con una concentración espermática >150x106 esp/ml y motilidad progresiva >80%. Tres protocolos fueron ensayados: grupo 1: SYBR-14/PI, grupo 2: 6-CFDA/PI y grupo 3: PI. La integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides fue similar entre grupos 1 y 2, independiente del fluorocromo utilizado (37,26±13,9 y 33,8±14,6, respectivamente; p=0,4601). Asimismo, la viabilidad espermática entre los grupos 1, 2 y 3 (62,7±13,9, 66,1±14,6 y 66,4±13,3, respectivamente; p=0,8987). En conclusión, no se evidenció diferencias en la efectividad para determinar la viabilidad e integridad de la membrana plasmática mediante la utilización de SYBR-14 y 6-CFDA, ambas tinciones pueden ser incorporadas al análisis de rutina de semen canino de raza Chihuahua.

In applying reproductive techniques in vitro it is important to determine the fertilizing capacity of the sperm, for this a combination of dyes were used to assess different parameters of sperm function, thereby increasing the accuracy of the estimation of the sample. In dogs (Canis lupus familiaris) Chihuahua breed there is no precedent for evaluating sperm function parameters. The aim was to assess the viability and plasmatic membrane integrity, basic parameters of sperm function. Propidium iodide (PI) was used, a fluorescent dye-specific DNA, which combined with fluorochromes permeable acts as marker of the sperm membrane integrity. The effectiveness of the use of 6-CFDA and SYBR-14 fluorochromes combined with PI was also compared to determine viability and sperm membrane integrity using flow cytometry. Fresh semen of dogs (n=5) Chihuahua breed was used with a concentration of >200x106 sp/ml and progressive motility >80%. Three protocols were performed: group 1: SYBR-14/PI, group 2: 6-CFDA/PI and group 3: PI. The plasma membrane integrity of sperm was similar, independent of the fluorophore used between groups 1 and 2 (13.9±37.26 and 33.8±14.6, respectively, p=0.4601). This also applied to sperm viability between groups 1, 2 and 3 (62.7±13.9, 66.1±14.6 and 66.4±13.3, respectively, p=0.8987). No difference was demonstrated in effectiveness to determine the viability and integrity of the sperm membrane using SYBR-14 and 6-CFDA, both dyes can be incorporated in to routine analysis of semen in canine Chihuahua breed.