Identificación por PCR-SSCP de genes de cefotaximasas en aislamientos hospitalarios de Enterobacteriaceae / Identification of genes for cefotaximases in hospital isolates of Enterobacteriaceae by PCR-SSCP

Las cefotaximasas (CTX-M) son las beta-lactamasas de espectro extendido más ampliamente diseminadas entre especies de la familia Enterobacteriaceae, y son la causa principal de resistencia en aislamientos causantes de infección intrahospitalaria. El objetivo del presente trabajo fue identificar variantes de cefotaximasas del grupo CTX-M-1 mediante el análisis del polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP) de frag-mentos de restricción provenientes de los productos de la amplificación por PCR de los genes blaCTX-M. Con el procedimiento PCR-SSCP estandarizado, en este trabajo se analizaron 49 aislamientos de enterobacterias recolectados en 8 hospitales de Bogotá, D.C., adscritos a la Secretaría Distrital de Salud. Se detectaron las variantes CTX-M-12, CTX-M-15, CTX-M-12a, y CTX-M-1 y una nueva variante denominada CTX-M-60. Todas las variantes fueron detectadas tanto en aislamientos intrahospitalarios como de la comunidad, lo que indica posible movilidad de estos genes desde y hacia los centros hospitalarios. Esta publicación constituye el primer reporte en Colombia de la variante CTXM-12a y la nueva variante evolutiva CTX-M-60.

CTX-M cefotaximases are the most widely distributed extended-spectrum beta-lactamases among Enterobacteriaceae and they are an important cause of microbial resistance in nosocomial infection-causing isolates. The object of this work was to identify group 1 CTX-M cefotaximase variants from PCR amplified blaCTX-M genes by single-stranded conformational polymorphism of restriction fragments (RF-SSCP). We analysed 49 Enterobacteria isolates using the RF-SSCP procedure standardised in this work; isolates were collected from eight hospitals attached to the Bogota Health Secretariat (Secretaría Distrital de Salud). CTX-M-12, CTX-M-15, CTX-M-12a and CTX-M-1 variants were detected as well as a new one, designated CTX-M-60. All variants were detected in hospital and community isolates thereby indicating these genes’ possible high mobility from and towards hospital centres. This study represents the first report in Colombia of CTXM-12a and of the new evolutionary variant: CTX-M-60.

Ambiente genético del gen blaCTX-M-12 en aislamientos hospitalarios de klebsiella pneumoniae / The blaCTX-M-12 gene's genetic environmnt in klebsiella pneumoniae hospital isolates

En Colombia se han detectado genes del grupo CTX-M-1 con alta frecuencia en aislamientos de Klebsiella pneumoniae causantes de infección intrahospitalaria. El conocimiento de los factores genéticos que pueden favorecer la diseminación de estos genes entre especies bacterianas es un aspecto importante para el control de la resistencia. En este estudio se identificaron los plásmidos portadores del gen blaCTX-M-12 en 21 aislamientos clínicos de K. pneumoniae. Se evaluó por conjugación la transferencia de resistencia a antibióticos. Integrones, secuencias de inserción y otros elementos genéticos fueron detectados por amplificación del ADN plasmídico con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mediante análisis por PCR se determinó la relación entre el gen blaCTX-M-12 y los elementos genéticos detectados. En todos los aislamientos, el gen blaCTX-M-12 se encontró en plásmidos conjugativos de tamaños entre 65 y 106 kpb. La transferencia por conjugación de estos elementos móviles puede explicar la amplia diseminación de este gen entre enterobacterias causantes de infección nosocomial en hospitales de Bogotá, Colombia. El gen blaCTX-M-12 se encontró corriente abajo de ISEcp1, secuencia de inserción que se ha asociado con la movilización de determinantes genéticos de resistencia. Los promotores de ISEcp1, detectados por análisis de secuencia, pueden facilitar la expresión de la cefotaximasa codificada por este gen.

Genes from CTX-M-1 group have been detected with great frequency in Colombia in intrahospital infection-causing Klebsiella pneumoniae isolates. Knowledge regarding the genetic factors favouring such genes’ dissemination amongst bacterial species is an important issue for resistance control blaCTX-M-12 gene-carrying plasmids were identified in this study in 21 clinical K. pneumoniae isolates. Antibiotic resistance transfer was evaluated by mating. Integrons, insertion sequences and other genetic elements were detected by plasmid DNA amplification using polymerase chain reaction (PCR). The relationship between the blaCTX-M-12 gene and other genetic elements was determined by PCR analysis. The blaCTX-M-12 gene was disemifound on 52 to 106 Kpb conjugative plasmids in all isolates. These mobile elements’ transfer by mating may explain their wide dissemination amongst nosocomial infection-causing enterobacteria in hospitals in Bogota, Colombia. The blaCTX-M-12 gene was found downstream from ISEcp1, this being an insertion sequence which has been associated with resistance genetic determinants’ mobilisation. ISEcp1 promoters (detected by sequence analysis) may increase the expression of cefotaximase encoded by this gene.

Evaluación preliminar de toxicidad, genotoxicidad y actividad antimicrobiana de Sida rhombifolia L / Preliminary evaluation of Sida rhombifolia L toxicity genotoxicity and antimicrobial activity

La actual predisposición a consumir productos naturales y, en muchas regiones, la difícil disponibilidad y accesibilidad a los medicamentos han llevado a las poblaciones del mundo a buscar otras alternativas para aliviar sus dolencias. Una de las más difundidas ha sido el regreso a la medicina ancestral, lo cual ha provocado un aumento en el consumo de fitoterapéuticos. En Colombia, el uso de los fitomedicamentos está muy extendido y, dentro de ellos, en esta investigación se seleccionó la planta Sida rhombifolia L. a la cual se le realizó la evaluación de la toxicidad de extractos y fracciones utilizando como organismosde prueba Daphnia magna, Hydra attenuata y Artemia salina. La actividad biológica fue evaluada mediante la prueba de sensibilidad a antimicrobianos y la genotoxicidad con el ensayo Cometa. Los ensayos de toxicidad aguda con los organismos de prueba muestran que los extractos acuosos son prácticamenteno tóxicos (CL50 >1000 ppm), lo cual sugiere que su uso en forma de infusión es seguro. Los extractos etanólicos y las fracciones de acetato de etilo y cloroformo presentaron actividad antimicrobiana frentea Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa que puede ser atribuida a los metabolitos secundarios(terpenoides, flavonoides) que están presentes en esta especie. Los extractos etanólicos presentaron una importante actividad genotóxica sobre los linfocitos en el ensayo Cometa, siendo el extracto etanólico de raíces el que presenta mayor genotoxicidad (CL50 35 ppm). Es importante señalar que el extracto acuoso de hojas presenta una baja genotoxicidad (CL50 900 ppm), lo cual es relevante si se toma en consideración que es la parte de la planta tradicionalmente utilizada por las comunidades indígenas ubicadas en la Sierra Nevada de Santa Marta.

Diseño de un modelo bioinformática para la detección, identificación y clasificación de genes codificantes de ß-lactamasas, como herramienta para el cruce de datos moleculares con datos clínicos / Bioinformatics model design for the detection, identification and classification of ß-lactamases genes, as a tool for crossing molecular data with clinical data

El seguimiento epidemiológico y farmacológico de la resistencia a antibióticos ß-lactámicos mediada por la presencia de ß-lactamasas requiere identificación precisa, lo cual es posible mediante la secuencia del gen, que es identificado con herramientas bioinformáticas que se incorporan a sistemas de información. Para implementar un prototipo de sistema de información que permite clasificar secuencias de genes de ß-lactamasas producidas por microorganismos resistentes aislados en hospitales y realizar su cruce con los datos clínicos, se obtuvieron las secuencias de ß-lactamasas reportadas a escala mundial en la base de datos Uniprot utilizando el sistema de recuperación de secuencias (SRS) del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI), se diseñó un sistema de datos moleculares y clínicos usando "Unified Modeling Language" (UML), y se generó un modelo implementado en un servidor con sistema operativo UNIX, gestor de bases de datos MySQL para realizar la creación de la base de datos y lenguajes de programación Perl y PHP para implementar programas y cruzar datos. El sistema de información BLA-ID-CLINIC permite hacer el cruce de datos moleculares y clínicos, de tal forma que se puedan identificar las ß-lactamasas de microorganismos resistentes en hospitales y hacer un seguimiento del manejo de los antibióticos y el comportamiento epidemiológico, modelo bioinformático permanentemente actualizado, disponible a través de Internet en http://bioinf.ibun.unal.edu.oc/BLA_ID_CLINIC.

The epidemiology and pharmacology of the b-lactamic antibiotics resistance at hospital level mediate by the presence of ß-lactamasas requires of their precise identification, possible through the gene sequence that can be identified using bioinformatics tools and incorporated into the information systems. Prototype of information system BAL-ID-CLINIC was implemented for allowing genes sequences classification of ß-lactamases produced by isolated resistant microorganisms in hospitals and their crossing with the clinical data. The information system was development using Unified Modeling Language UML and the prototype was implemented in an Unix server, using MySQL management system for data base building and Perl and PHP as a programming languages for writing scripts that obtain cross relationship between the different kind of data inside the system and the result report presentation. BLA-ID-CLINIC allows crossing of molecular and clinical data. It can identify ß-lactamasas produced by resistant microorganisms isolated in hospital patients and can give information related with the antibiotics management and the epidemiologic behavior. The bioinformatics prototype BLA-ID-CLINIC is permanently updated and available through Internet in http://bioinf.ibun.unal.edu.oc/BLA_ID_CLINIC.