Uso de una conantokina y anticuerpos policlonales para identificar la subunidad NR2B del receptorn-metil-d-aspartato / The use of conantokin and polyclonal antibodies to identify the NR2B subunit of the n-methyl-d-aspartate receptor

Objetivo. Proponer una metodología de identificación de la subunidad NR2B, mediante el uso de conantokina G, así como una adecuada extracción de la subunidad NR2B. Materiales y métodos. Se ensayaron dos metodologías para la extracción de la subunidad NR2B de cerebro de rata adulta, la primera buscó la extracción de la subunidad a partir de la membrana mediante la utilización del detergente deoxicolato de sodio y la segunda, garantizó primero la solubilización y eliminación de proteínas citoplasmáticas para luego realizar la extracción de la subunidad mediante el uso del mismo detergente, a partir del pellet generado en la centrifugación del extracto obtenido. Adicionalmente se biotiniló la conantokina G para evaluar su eficiencia en la identificación de la subunidad y comparar los resultados con los obtenidos por metodologías tradicionales como DOT-BLOT, WESTERN-BLOT, ELISA e Inmunohistoquímica. Resultados. La segunda metodología mostró mayor extracción de NR2B por lo que se seleccionó para la realización de los extractos posteriores. Los ensayos de identificación con la conantokina biotinilada evidenciaron interferencia en el reconocimiento, haciéndose necesaria la identificación de la presencia de la subunidad NR2B mediante el uso de anticuerpos policlonales en los ensayos mencionados. Conclusiones. Se propone que hay un impedimento de tipo estérico en el marcaje de la conantokina con la biotina lo que no favorece la interacción de este péptido con la subunidad.

Purificación de IgY contra la subunidad NR3 del receptor NMDA de cerebro de rata / Purification of IgY against the NR3 subunit of the rat brain NMDA receptor

Objetivo. Obtener anticuerpos tipo IgY contra péptidos sintéticos de las subunidades NR3A y NR3B del receptor NMDA de ratas, para reconocer y seguir la expresión de estas subunidades en extractos de cerebro de rata de diferentes edades. Materiales y métodos. Se diseñaron dos péptidos empleando los sistemas de la base de datos Entrez y el programa ClustalWPBIL de alineamientos múltiples contra las subunidades NR3A y NR3B del receptor NMDA; una vez sintetizados por el método SSPS-fmoc fueron utilizados para inocular gallinas (Gallus gallus, variedad Hy Line Brown) de 16 semanas de edad; al cabo de 57 días postinoculación se purificó IgY específica y se enfrentaron a extractos de cerebro de rata postnatal y adulta. Resultados. Se detectaron las subunidades NR3A y NR3B y se relacionó su expresión con la edad del animal; siendo mayor la expresión de la subunidad NR3A en extracto de cerebro de rata postnatal. No se encontró diferencia marcada en la expresión de la subunidad NR3B en las edades mencionadas. Conclusiones. Esta es la primera investigación que emplea proteína nativa para el reconocimiento de la subunidad NR3 del receptor NMDA, lo cual muestra la especificidad de los anticuerpos generados y contribuye con el entendimiento de las funciones de este receptor y su relación con la regulación de la memoria espacial.