A comparison of four DNA extraction protocols for the analysis of urine from patients with visceral leishmaniasis

Introduction Polymerase chain reaction (PCR) may offer an alternative diagnostic option when clinical signs and symptoms suggest visceral leishmaniasis (VL) but microscopic scanning and serological tests provide negative results. PCR using urine is sensitive enough to diagnose human visceral leishmaniasis (VL). However, DNA quality is a crucial factor for successful amplification. Methods A comparative performance evaluation of DNA extraction methods from the urine of patients with VL using two commercially available extraction kits and two phenol-chloroform protocols was conducted to determine which method produces the highest quality DNA suitable for PCR amplification, as well as the most sensitive, fast and inexpensive method. All commercially available kits were able to shorten the duration of DNA extraction. Results With regard to detection limits, both phenol: chloroform extraction and the QIAamp DNA Mini Kit provided good results (0.1 pg of DNA) for the extraction of DNA from a parasite smaller than Leishmania (Leishmania) infantum (< 100fg of DNA). However, among 11 urine samples from subjects with VL, better performance was achieved with the phenol:chloroform method (8/11) relative to the QIAamp DNA Mini Kit (4/11), with a greater number of positive samples detected at a lower cost using PCR. Conclusion Our results demonstrate that phenol:chloroform with an ethanol precipitation prior to extraction is the most efficient method in terms of yield and cost, using urine as a non-invasive source of DNA and providing an alternative diagnostic method at a low cost. .

Case study of appatient with hiv-aids and visceal leishmaniasis co-infection iin multiple episodes / Estudo de caso de paciente com multiplos episodios da coinfeccao HIV-AIDS e leishmaniose visceral

SUMMARY Report of a 45-year-old male farmer, a resident in the forest zone of Pernambuco, who was diagnosed with human immunodeficiency virus (HIV) in 1999 and treated using antiretroviral (ARV) drugs. In 2005, the first episode of visceral leishmaniasis (VL), as assessed by parasitological diagnosis of bone marrow aspirate, was recorded. When admitted to the hospital, the patient presented fever, hepatosplenomegaly, weight loss, and diarrhea. Since then, six additional episodes of VL occurred, with a frequency rate of one per year (2005-2012, except in 2008). In 2011, the patient presented a disseminated skin lesion caused by the amastigotes of Leishmania, as identified by histopathological assessment of skin biopsy samples. In 2005, he was treated with N-methyl-glucamine-antimony and amphotericin B deoxycholate. However, since 2006 because of a reported toxicity, the drug of choice was liposomal amphotericin B. As recommended by the Ministry of Health, this report emphasizes the need for HIV patients living in VL endemic areas to include this parasitosis in their follow-up protocol, particularly after the first infection of VL. .

RESUMO Relato de caso de paciente masculino de 45 anos, agricultor, residente na zona da mata do Estado de Pernambuco, diagnosticado com HIV em 1999 e em uso de ARV. Em 2005 foi registrada a primeira ocorrência de LV através do diagnóstico parasitológico a partir do aspirado da medula óssea. À admissão no hospital apresentava-se com febre, hepatoesplenomegalia, perda de peso e diarréia. Desde então houve a ocorrência de mais sete episódios de LV, tendo ocorrido em media, um evento a cada ano (2005-2012 exceto em 2008). O paciente apresentou, em 2011, um quadro cutâneo disseminado, sendo realizada biopsia de pele que evidenciou formas amastigotas de Leishmania no exame histopatológico. Em 2005, o tratamento foi realizado com antimoniato de N-metil-glucamina e anfotericina B desoxicolato, mas desde 2006, devido à toxicidade, o medicamento de escolha foi a anfotericina B lipossomal. Como recomendado pelo Ministério da Saúde, esse relato reforça a necessidade de que os casos de HIV residentes em área endêmica de LV deverão ter inserido em seu protocolo de acompanhamento essa parasitose, principalmente após o primeiro episódio. .

Desenvolvimento de sistemas baseados em Nested-PCR convencional e em único tubo para o diagnóstico de leishmaniose visceral / Development systems based on nested-PCR and conventional single tube for the diagnosis of visceral leishmaniasis

A leishmaniose visceral ocorre em países dos cinco continentes e quando não tratada pode levar a óbito. Para se evitar esse desfecho, são essenciais o diagnóstico precoce e tratamento adequado. Com o objetivo de contribuir na pesquisa de novos diagnósticos para leishmaniose visceral, esse trabalho propôs desenvolver sistemas baseados em Nested-PCR convencional e em único tubo para o diagnóstico de leishmaniose visceral. A partir de uma revisão na literatura em busca de alvos moleculares utilizados no diagnóstico dessa parasitose, foram selecionados os alvos subunidade menor do RNA ribossômico (ssu rRNA) e espaçador transcrito interno 1 (ITS-1), que compõem o DNA do agente etiológico Leishmania infantum, para o desenvolvimento das nested-PCR. Foi também escolhido o alvo kDNA, o mais aplicado nas abordagens de PCR, para comparações com os sistemas desenvolvidos. Após otimizar todas as PCR com DNA genômico de L. infantum, esses sistemas foram avaliados em amostras de sangue, soro e urina de indivíduos com suspeita de leishmaniose visceral dos hospitais de referência da cidade do Recife - PE. Para utilização da urina, foram avaliados quatro protocolos de extração de DNA e identificou-se que a extração por fenol-clorofórmio, com modificações, foi a de melhor desempenho. Na avaliação com amostras biológicas, as PCR simples e nested-PCR com os alvos ssu rRNA e ITS-1 não tiveram boa sensibilidade ao se usar sangue, e não foram capaz de amplificar DNA do parasito em soro e urina. Esses sistemas desenvolvidos não podem ser usados para o diagnóstico da leishmaniose visceral. No entanto, a kDNAPCR apresentou bons resultados quando avaliada com urina. Mais estudos devem ser feitos para avalia-la como um diagnóstico seguro para esse tipo de amostra biológica. Esse trabalho representa um ponto de início para posteriores estudos que objetivem o aprimoramento e validação da nested-PCR único tubo para o diagnóstico da leishmaniose visceral.

Avaliação da composição química de Cymbopogon citratus Stapf cultivado em ambientes com diferentes níveis de poluição e a influência na composição do chá / Evaluation of the chemical composition of Cymbopogon citratus Stapf growing in environments with different pollution levels and the influence on tea composition

Cymbopogon citratus Stapf, o popular capim-santo, é espécie originária da Índia, que chegou ao Brasil, possivelmente, no tempo colonial, e era utilizada como planta ornamental, sendo encontrada cultivada em todo o país. Diversos são os usos populares para essa planta, desde tratamento de dores estomacais, intestinais, antidiarreico, até anticelulite e estética de cabelos oleosos. Essa planta se desenvolve em ambientes insalubres como beira de estrada, e isso pode levar a mudanças no seu aspecto químico e, em consequência disso, mudanças em seus derivados. Este trabalho analisou se ocorreu variação da composição química da planta cultivada na presença ou ausência de estresse ambiental (poluição urbana). Foram pesquisados por meio de cromatografia de camada delgada os seguintes compostos: saponinas, iridoides e proantocianidinas, mono e sesquiterpenos, triterpenos e esteroides, luteolina, polifenóis e alcaloides. Concluiu-se que este fator pode ter contribuído para modificação da composição química de suas folhas, reduzindo a síntese de compostos mais polares e favorecendo a síntese de possíveis leucoantocianidinas para provável proteção. Isso poderá acarretar ao chá alterações em sua propriedade farmacológica e toxicológica.

Cymbopogon citratus Stapf, popularly known as lemongrass, is an Indian species. It possibly arrived in Brazil during colonial times, where it was used as an ornamental plant, and is found growing throughout the country. There are several popular uses for this plant, including as treatment for stomach pains, diarrhea and cellulite. This plant grows in polluted and unpolluted environments such as roadsides, which can lead to changes in its chemical aspects, and consequently changes in its manufacturing products. This study examined whether there were changes in the chemical composition of plants grown in the presence or absence of environmental stress (urban pollution). The following compounds were studied, using thin layer chromatography: saponins, iridoids and proanthocyanidins, mono- and sesquiterpenes, triterpenes and steroids, flavonoids, polyphenols and alkaloids. It was concluded that this factor may have contributed to changes in the chemical composition of its leaves, reducing the synthesis of more polar compounds and promoting synthesis of possible leucoanthocyanidins for possible protection. This can lead to changes in the pharmacological and toxicological properties of tea.

Filariose linfática: avanços e perspectivas do diagnóstico laboratorial: revisão / Lymphatic filariasis: progresses and perspectives of the laboratorial diagnostic: a review

A Filariose Linfática, também conhecida como elefantíase em sua fase crônica, é uma doença endêmica de regiões tropicais e subtropicais que possui como agente etiológico helmintos da espécie Wuchereria bancrofti. Enfermidade debilitante, de grave impacto sócio-econômico, acomete cerca de 120 milhões de pessoas em todo mundo. No Brasil, estima-se em 49 mil o número de indivíduos infectados, sendo estes encontrados principalmente no município de Maceió-AL e Região Metropolitana do Recife-PE. A dificuldade na realização do diagnóstico, a falta de saneamento básico e a alta densidade populacional de vetores fazem desta infecção uma endemia de difícil controle e erradicação, sendo, por esse motivo, alvo de inúmeros programas propostos pela OMS e OPAS. Associadas a esses programas, pesquisas têm sido realizadas com a finalidade de avaliar as técnicas atualmente disponíveis, bem comodesenvolver novos métodos de diagnóstico mais sensíveis e mais específicos, possibilitando assim uma redução no número de indivíduoscom formas mórbidas da doença. O objetivo do presente trabalho é fornecer informações relevantes acerca das técnicas disponíveis para o diagnóstico da Filariose Linfática, contribuindo assim para otimização dos laboratórios de análises clínicas.

Lymphatic Filariasis, also known as elephantiasis in your chronic phase, it is an endemic disease of tropical and subtropical areas that has the Wuchereria bancrofti helminthes which agent etiologic. Illness weakling of serious socioeconomic impact attacks about 120 million people in all the word. In Brazil, is possible that 49 thousand of individuals are infected, whose the majority live in the municipal district of Maceió and Recife Metropolitan Area. The difficulty in the development of the diagnosis, the lack of basic sanitation and the great population density of vectors they do of this infection an endemic disease of difficult control and eradication. Therefore this illness is target diverse WHO and OPAS programs. Together with the those programs, researches have been accomplished with the purpose of evaluating the techniques available in the moment, as well as to develop more sensitive and specific diagnosis methods, making possible a reduction in the number of individuals with morbid forms of the disease. The purpose of the present article is to supply important information about the available techniques for the diagnosis of Lymphatic Filariasis, contributing to optimization of the analyses clinical laboratories.

Avaliação da toxicidade subcrônica do extrato bruto seco de Anacardium occidentale Linn em cães / Evaluation of the subchronic toxicity of the crude dry extract of Anacardium occidentale Linn in dogs

A busca de novos medicamentos tem levado ao desenvolvimento de novos fármacos que sejam eficientes e destituídos de toxicidade. Uma das fronteiras nessas pesquisas são os medicamentos fitoterápicos. No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) regulariza essas pesquisas e padroniza os procedimentos. A Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) 48/2004, por exemplo, regulariza o registro de fitoterápicos. O Anacardium occidentale Linn está entre as plantas mais estudadas, devido às ações antibiótica e antiinflamatória de seus metabólitos secundários, principalmente taninos. Esta planta também possui a capacidade de impedir a formação da placa bacteriana bucal. Diante dessas ações, formas farmacêuticas acabadas (cremes e géis) foram desenvolvidas a partir do extrato bruto seco (EBS) das cascas do caule do A. occidentale Linn para registro de um novo fitomedicamento. Entretanto, testes pré-clínicos e clínicos devem ser feitos de acordo com a lei vigente. O presente trabalho avaliou a toxicidade subcrônica do EBS em cães sem raça definida (SRD). Os testes revelaram apenas hepatotoxicidade transitória demonstrada pela elevação dos níveis da alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST).

Research on new medicaments has led to the development of efficient and non-toxic drugs. In Brazil, the Agência Nacional de Vigilância Sanitária (National Department of Sanitary Supervision - ANVISA) regularizes and standardizes the procedure. Anacardium occidentale is amongst the most researched plants, due to the antibiotics and antinflammatory properties of its secondary metabolites, mainly tannins and flavonoids. Furthermore, it prevents the dental plaque formation. On account of these actions, finished pharmaceutical forms (creams and gels) were developed from the crude dry extract (CDE) of A. occidentale Linn stem rinds, in order to register a new form. However, pre-clinical and clinical assays can be made in accordance with the effective law. The present work evaluated the subchronic toxicity of the CDE in dogs of indefinite pedigree. Data showed an increase of alanine transaminase (ALT) and aspartate transaminase (AST) levels, which may indicate transitory hepatotoxicity.