RESUMEN
Os primeiros estudos demonstrando o potencial de trandiferenciação neural das células-tronco mesenquimais (CTMs) provenientes da medula óssea (MO) foram conduzidos em camundogos e humanos no início da década de 2000. Após esse período, o número de pesquisas e publicações com o mesmo propósito tem aumentado, mas com raros ou escassos estudos na espécie equina. Nesse sentindo, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial in vitro da transdiferenciação neural das CTMs provenientes da MO de equinos utilizando-se dois protocolos: P1 (forksolin e ácido retinóico) e P2 (2-βmecarptoetanol). Após a confirmação das linhagens mesenquimais, pela positividade para o marcador CD90 (X=97,94%), negatividade para o marcador CD34 e resposta positiva a diferenciação osteogênica, as CTMs foram submetidas a transdiferenciação neural (P1 e P2) para avaliação morfológica e expressão dos marcadores neurais GFAP e β3 tubulina por citometria de fluxo. Os resultados revelaram mudanças morfológicas em graus variados entre os protocolos testados. No protocolo 1, vinte quatro horas após a incubação com o meio de diferenciação neural, grande proporção de células (>80%) apresentaram morfologia semelhante a células neurais, caracterizadas por retração do corpo celular e grande número de projeções protoplasmáticas (filopodia). Por outro lado, de forma comparativa, já nos primeiros 30 minutos após a exposição ao antioxidante β-mercaptoetanol (P2) as CTMs apresentaram rápida mudança morfológica caracterizada principalmente por retração do corpo celular e menor número de projeções protoplasmáticas. Também ficou evidenciado com o uso deste protocolo, menor aderência das células após tempo de exposição ao meio de diferenciação, quando comparado ao P1. Com relação a análise imunofenotípica foi observado uma maior (P<0,001) expressão dos marcadores GFAP e β3 tubulina ao término do P2 quando comparado ao P1. A habilidade das CTMs em gerar tipos celulares relacionados a linhagem neural é complexa e multifatorial, dependendo não só dos agentes indutores, mas também do ambiente no qual estas células são cultivadas. Desta forma um maior número de estudos é necessário para o melhor entendimento do processo de transdiferenciação neural a partir de CTMs de equinos.
The first studies showing the potential of neural transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow (BM) were conducted in camundogos and humans in the early 2000s. After this period, the number of research and publications with the same purpose increased, but with rare or scarce studies in horses. The aim of this study was to evaluate in vitro neuronal transdifferentiation potential of MSCs from equine BM using two protocols: P1 (forksolin and retinoic acid) and P2 (2-βmecarptoetanol). After confirming the mesenchymal lineages, by positivity for the marker CD90 (X=97.94%), negative for the marker CD34 and positive response for osteogenic differentiation, MSCs were subjected to neural transdifferentiation (P1 and P2) for morphological analysis and expression of neural markers GFAP and β3 tubulin by flow cytometry. The results revealed morphological changes in varying degrees between the tested protocols. In protocol 1, twenty four hours after incubation with the media of neural differentiation, a large proportion of cells (>80%) had similar morphology to neural cells, characterized by retraction of cellular body and a large number of cytoplasmic extension (filopodia). However, comparatively, within the first 30 minutes after exposure to the antioxidant β-mercaptoethanol (P2) MSCs showed rapid morphological changes characterized mainly by retraction of cellular body and less cytoplasmic extension. It was also evidenced with the use of this protocol, lower cellular adhesion after exposure to media when compared to P1. Regarding the immunophenotyping analysis it was observed a higher (P<0.001) expression of the markers GFAP and β3 tubulin at the end of P2 compared to P1. The ability of MSCs to generate cell types related to neural lineage is complex and multifactorial, depending not only of inducing agents, but also the environment in which these cells will be cultivated. Thus a greater number of studies are necessary to better understand the process of neural transdifferentiation of MSCs from equine.
Asunto(s)
Animales , Linaje de la Célula , Caballos/genética , Células Madre Mesenquimatosas , Médula Ósea/fisiología , Osteogénesis/genética , Transdiferenciación Celular/genética , Citometría de Flujo/veterinaria , Glucosa/genética , Medios de Cultivo/aislamiento & purificación , Técnicas de Cultivo de Célula/veterinariaRESUMEN
A pesquisa de Salmonella em carcaças de aves tem mostrado resultados discrepantes, dependendo se as amostras foram colhidas ainda na indústria, imediatamente após o chiller ou no comércio varejista, quando se encontram submetidas à refrigeração por vários dias. Técnicas mais sensíveis, tais como a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), podem fornecer dados importantes sobre o efeito do resfriamento sobre as células do patógeno, comparando seus resultados com os da metodologia microbiológica convencional (MC). Foram colhidas 130 carcaças de frango, sendo que 65 foram obtidas ainda na indústria (pós-chiller) e imediatamente analisadas e 65 carcaças embaladas e estocadas a 5°C por 72 horas (simulando o varejo), sendo então realizada a pesquisa do patógeno por ambas as técnicas. Do total analisado (130 amostras), a PCR foi capaz de detectar 58 positivas (44,6 por cento) e a MC 50 (38,5 por cento). Ambas as técnicas detectaram um número superior de amostras positivas para Salmonella em carcaças colhidas ainda na indústria, quando comparadas às do varejo. A PCR detectou 50,77 por cento de positividade em amostras da indústria e 38,46 por cento em amostras do varejo. Para a MC, esses valores foram de 46,15 por cento (indústria) e 30,77 por cento (varejo). Concluímos que o resfriamento das carcaças a 5°C por 72 horas pode ser um fator limitante na detecção de Salmonella quando a pesquisa do patógeno se faz pela metodologia microbiológica convencional.
The survey of Salmonella in poultry carcasses has shown conflicting results, depending on whether the samples were taken yet in the factory, immediately after the chiller or retail market, when they are subjected to refrigeration for several days. More sensitive techniques such as Polymerase Chain Reaction (PCR) can provide important data on the effect of cooling on the cells of the pathogen by comparing their results with those of conventional microbiological methods (CM). It was collected 130 chicken carcasses, wich 65 were obtained yet in the industry (post-chiller) and immediately analyzed and 65 carcasses packaged and stored at 5°C for 72 hours (simulating retail), and then research of the pathogen was performed by both techniques. Of the analyzed total (130 samples), PCR was able to detect 58 positive (44.6 percent) and CM, 50 (38.5 percent). Both techniques detected a higher number of samples positive for Salmonella on carcasses collected yet in the factory when compared to those of retail. The PCR detected 50.77 percent of positive industry samples and 38.46 percent of retail samples. CM for these values was 46.15 percent (factory) and 30.77 percent (retail). We conclude that the cooling of the carcasses for at 5°C for 72 hours can be a limiting factor in the detection of Salmonella when the pathogen research is done by conventional microbiological methods.