RESUMEN
Resumen Este trabajo tuvo como objetivo investigar la presencia de factores de virulencia, resistencia a antimicrobianos y metales pesados en 97 enterococos aislados de alimentos de origen animal. Se realizaron pruebas fenotípicas y genotípicas para la identificación a nivel de especie de los enterococos recuperados. Se identificaron 67 aislados como Enterococcus faecium, 9 como Enterococcus faecalis, 3 como Enterococcus durans, 2 como Enterococcus hirae y 1 como Enterococcus raffinosus. En 15 aislados no se logró su confirmación a nivel de especie por métodos fenotípicos ni genotípicos. La producción de exopolisacáridos fue el factor de virulencia más frecuente y se detectó en 46 enterococos, mientras que 19 exhibieron actividad gelatinasa y solo uno presentó beta-hemólisis. El estudio de la concentración inhibitoria mínima (CIM) reveló que 29 aislados resultaron resistentes a vancomicina (≥32 μg/mL) y 26 de ellos también eran resistentes a teicoplanina (≥32 μg/mL). Del total de aislamientos, 21 presentaron resistencia a tetraciclina (≥16 μg/mL) y sólo 3 exhibieron resistencia a la ampicilina (≥16 μg/mL). La prueba en agar reveló que 90 cepas resultaron resistentes al zinc (≥12 mM) mientras que todas exhibieron resistencia intermedia al cobre (4-12 mM). Los alimentos de origen animal actúan como reservorios de cepas de Enterococcus spp. que expresan factores de virulencia y resistencia a los antimicrobianos y a metales pesados. La implementación de una vigilancia continua en enterococos aislados de alimentos de origen animal es esencial para la salud humana.
Abstract This study was aimed at investigating the presence of virulence factors, antimicrobial and heavy metals resistance in 97 isolated enterococci from food of animal origin. Phenotypic and genotypic tests for species-level identification of the recovered isolates were carried out. This resulted in the iden tification of 67 strains as Enterococcus faecium, 9 as Enterococcus faecalis, 3 as Enterococcus durans, 2 as Enterococcus hirae and 1 as Enterococcus raffinosus. In 15 isolates, their confirmation at species level was neither achieved by phenotypic nor by genotypic methods. Exopolysaccharides production was the most frequent virulence factor and was detected in 46 isolates, while 19 displayed gelatinase activity, and only one resulted beta-hemolytic. Minimum inhibitory concentration (MIC) study revealed that 29 isolates were vancomycin-resistant (≥32 μg/mL), 26 of them were also resistant to teicoplanin (≥32 μg/mL). On the other hand, of the total isolates, 21 exhibited resistance to tetracycline (≥16 μg/mL) and only 3 enterococci exhibited resistance to ampicillin (≥16 μg/mL). Agar plates test revealed that 90 strains were resistant to zinc (≥12 mM) while all exhibited intermediate copper resistance (4-12 mM). Foods of animal origin act as a reservoir of Enterococcus spp. strains, expressing virulence factors, and resistance to antimicrobials and heavy metals. Therefore, the implementation of continuous surveillance in enterococci isolated from food of animal origin is essential to human health.
Resumo O objetivo deste trabalho foi investigar a presença de fatores de virulência, resistência a antimicrobianos e metais pesados em 97 enterococos isolados de alimentos de origem animal. Foram realizadas provas fenotípicas e genotípicas para a identificação no nível de espécie dos enterococos recuperados. Foram identificados 67 isolados como Enterococcus faecium, 9 de Enterococcus faecalis, 3 de Enterococcus durans, 2 como Enterococcus hirae e 1 como Enterococcus raffinosus. Em 15 isolados, sua confirmação em nível de espécie não foi alcançada por métodos fenotípicos e/ou genotípicos. A produção de exopolissacarídeos foi o fator de virulência mais frequente e se detectou em 46 enterococos, enquanto que 19 apresentaram atividade de gelatinase e somente um apresentou beta-hemólise. O estudo da concentração inibitória mínima (CIM) revelou que 29 isolados eram resistentes à vancomicina (≥32 μg/mL), e 26 deles foram também resistentes a teicoplanina (≥32 μg/mL). Pelo contrário, da quantidade total de isolamentos, somente 21 apresentaram resistência à tetraciclina (≥16 μg/mL) e apenas 3 cepas apresentaram resistência à ampicilina (≥16 μg/mL). A prova em ágar revelou que 90 cepas eram resistentes ao zinco (≥12 mM), enquanto que todas mostraram resistência intermediária ao cobre (4-12 mM). Os alimentos de origem animal atuam como reservatórios de cepas de Enterococcus spp. os quais expressam fatores de virulência, e resistência aos antimicrobianos e a metais pesados. A implementação de uma vigilância contínua em enterococos isolados de alimentos de origem animal é essencial para a saúde dos humanos.
RESUMEN
Resumen Se aislaron del contenido intestinal del mejillón patagónico dos cepas de bacterias ácido lácticas y se caracterizaron por pruebas fenotípicas y moleculares. Los aislamientos se identificaron como Enterococcus hirae y fueron denominados E. hirae 463Me y 471Me. Por técnicas de PCR se identificó el gen de la enterocina P en ambas cepas, mientras que solamente en la cepa 471Me se detectó la enterocina hiracin JM79. Ambas cepas resultaron sensibles a los antibióticos clínicamente importantes y entre los rasgos de virulencia investigados mediante amplificación por PCR solo se pudieron detectar los genes cylL l y cylL s , sin embargo, no se observó actividad hemolítica en la prueba de agar sangre. Los sobrenadantes libres de células resultaron activos contra todas las cepas de Listeria y Enterococcus ensayadas, contra Lactobacillus plantarum TwLb 5 y contra Vibrio anguilarum V10. En óptimas condiciones de crecimiento, ambas cepas mostraron actividad inhibitoria contra Listeria innocua ATCC 33090 después de 2h de incubación. E. hirae 471Me alcanzó una actividad inhibitoria máxima de 163.840UA/ml después de 6h de incubación, mientras que el mismo valor se registró para E. hirae 463Me después de 8h. En ambos casos, la actividad antagonista alcanzó su máximo antes de lograr la fase estacionaria y permaneció estable hasta las 24h de incubación. En nuestro conocimiento, este es el primer informe de aislamiento de cepas bacteriocinogénicas de E. hirae de mejillón patagónico. La alta actividad inhibitoria y la ausencia de rasgos de virulencia indican que estos microorganismos podrían aplicarse en áreas biotecnológicas como la biopreservación de alimentos o las formulaciones probióticas.
Abstract Two bacteriocin-producing lactic acid bacterial strains were isolated from the intestinal content of the Patagonian mussel and characterized by phenotypic and molecular tests. The isolates were identified as Enterococcus hirae and named E. hirae 463Me and 471Me. The presence of the enterocin P gene was identified in both strains by PCR techniques, while enterocin hiracin JM79 was detected only in the 471Me strain. Both strains were sensitive to clinically important antibiotics and among the virulence traits investigated by PCR amplification, only cylL l and cylL s could be detected; however, no hemolytic activity was observed in the blood agar test. Cell free supernatants were active against all Listeria and Enterococcus strains tested, Lactobacillus plantarum TwLb 5 and Vibrio anguilarum V10. Under optimal growth conditions, both strains displayed inhibitory activity against Listeria innocua ATCC 33090 after 2h of incubation. E. hirae 471Me achieved a maximum activity of 163840AU/ml after 6h of incubation, while the same value was recorded for E. hirae 463Me after 8h. In both cases, the antagonist activity reached its maximum before the growth achieved the stationary phase and remained stable up to 24h of incubation. To our knowledge, this is first report of the isolation of bacteriocinogenic E. hirae strains from the Patagonian mussel. The high inhibitory activity and the absence of virulence traits indicate that they could be applied in different biotechnological areas such as food biopreservation or probiotic formulations.
Asunto(s)
Animales , Bacteriocinas/biosíntesis , Mytilus edulis/microbiología , Enterococcus hirae/aislamiento & purificación , Enterococcus hirae/metabolismo , Contenido Digestivo/microbiología , Enterococcus hirae/fisiologíaRESUMEN
La contaminación por metales pesados (MP) constituye un problema creciente para la salud pública. La utilización de bioindicadores permite evaluar el impacto de la contaminación antrópica. En este estudio se evaluaron 730 cepas de Enterococcus provenientes de diferentes fuentes de la comarca VIRCh-Valdés (Provincia de Chubut), mediante la prueba de sensibilidad a Pb++ por el método de dilución en placa, a concentraciones comprendidas entre 50 mg/L y 1.200 mg/L. De las cepas evaluadas, 223 exhibieron resistencia a plomo a concentraciones ≥ 50 mg/L. Dentro de este grupo se seleccionaron 22 aislados altamente resistentes a plomo (≥ 800 mg/L) con el objetivo de evaluar su resistencia a otros metales pesados, resistencia a antibióticos y determinar sus factores de virulencia. Todas las cepas seleccionadas mostraron alta sensibilidad a Hg++, un patrón variable de resistencia frente a Cd++ y Cr+6 y resistencia moderada a Ni++. Las cepas resultaron susceptibles a ampicilina y penicilina, y presentaron un patrón variable de resistencia a los restantes antibióticos ensayados. Entre los factores de virulencia, se detectó actividad de gelatinasa en dos cepas y sólo una cepa exhibió actividad hemolítica. Estos resultados sugieren una relación entre la resistencia a metales pesados, resistencia a antibióticos y factores de virulencia en cepas de Enterococcus aisladas del medio ambiente.
Contamination by heavy metals is a growing problem for public health and the use of bio-indicators are means for assessing anthropogenic pollution. In this study 730 Enterococcus strains were isolated from different sources of the region VIRCh - Valdés (Province of Chubut) were tested for sensibility to Pb++ by the plate dilution method at concentrations ranging from 50 mg/L to 1200 mg/L. A total of 223 strains displayed resistance to lead at concentration ≥ 50 mg/L. Among this group, and on the basis of its high resistance to lead (≥ 800 mg/L), 22 strains were selected with the goal to determine antibiotic and heavy metal resistance pattern and also the presence of virulence traits. All isolates showed high sensibility to Hg++, a variable pattern against Cd++ and Cr+6, and moderate resistance to Ni++. The strains were all susceptible to ampicillin and penicillin and displayed a variable pattern of resistance towards the remaining antibiotics assayed. Among the virulence traits determined, gelatinase production was detected in 2 strains and only one isolate showed hemolytic activity. The results obtained in this work suggest a relationship between heavy metal resistance, antibiotic resistance and virulence factors in Enterococcus strains isolated from the environment.
RESUMEN
Enterococcus mundtii Tw56 es una cepa productora de bacteriocina que fue aislada del contenido intestinal de pejerrey (Odontesthes sp.). El objetivo del presente trabajo fue determinar los factores fisicoquímicos y la composición del medio de cultivo para lograr un mayor rendimiento de células viables y producción de bacteriocina. No se observaron cambios en la producción del antimicrobiano cuando la glucosa fue sustituida por fructosa o maltosa en la formulación del medio MRS. Por el contrario, la mayor actividad de las bacteriocinas se obtuvo cuando se utilizó el extracto de carne como fuente única de nitrógeno. Mientras que la máxima biomasa se alcanzó a 35 °C, las temperaturas óptimas para la producción de bacteriocina se observaron a 25 y 30 °C. El pH inicial óptimo para el crecimiento celular y bioactividad fue 6,5, ambos parámetros disminuyeron cuando la experiencia comenzó a pH 6,0 o 5,5. La formación de biomasa y la producción de bacteriocina disminuyeron en presencia de cloruro de sodio. La cepa comenzó a producir bacteriocina en la fase exponencial tardía. La actividad aumentó en función de la masa celular y alcanzó el máximo al final de la fase exponencial (12 h). Una disminución de la actividad antimicrobiana se observó en la fase estacionaria (16 h), posiblemente debido a la degradación por enzimas proteolíticas.
Enterococcus mundtii Tw56 is a bacteriocin-producing strain that was isolated from intestinal content of silverside (Odontesthes sp.). The aim of the present work was to determine physicochemical factors and culture medium composition for higher yield of viable cells and bacteriocin production. No changes were observed in the antimicrobial production when glucose was replaced by fructose or maltose in the MRS medium formulation. On the other hand, highest bacteriocin activity was obtained when meat extract was used as a sole nitrogen source. While the maximun biomass was achieved at 35 ºC, the optimal temperatures for bacteriocin production were observed at 25 and 30 ºC. The optimal initial pH for cell growth and bioactivity was 6.5, both parameters dropped when the experience started at pH 6.0 or 5.5. Biomass formation and bacteriocin production decreased in the presence of sodium chloride. The strain started producing the bacteriocin at the late exponential phase. The activity increased as a function of the cell mass and reached the maximun at the end of exponential phase (12 h). A decrease of antimicrobial activity was observed in the stationary phase (16 h), possibly due to degradation by proteolitic enzimes.
RESUMEN
El fitato es la forma principal de almacenamiento de fósforo en semillas y granos, pero el fósforo unido a fitato resulta inaccesible para los peces. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la eficacia de Lactococcus lactis subsp. lactis Tw34 para liberar fósforo de fitato en un alimento experimental que contenía harina de cereal. La bacteria inoculante del ensilado biológico se seleccionó por su alta actividad de fitasa y las mezclas se prepararon con productos de descarte de merluza (Merluccius hubbsi). Las harinas de girasol, maíz, trigo y cebada se mezclaron con desechos picados de merluza hasta alcanzar el 25% y se inocularon con la bacteria citada. Después de 7 días de fermentación a 18 ºC los mejores resultados se obtuvieron cuando se utilizó harina de cebada. La cepa fue capaz de reducir el valor del pH a 4,4 y aumentar cuatro veces la concentración inicial de fósforo libre. Los resultados sugieren que la fitasa de Lactococcus lactis subsp. lactis Tw34 puede aumentar la accesibilidad del fósforo en dietas basadas en harina de cereales, evitando los efectos negativos del ácido fítico en la biodisponibilidad de minerales y proteínas, y disminuyendo la liberación de residuos de fósforo.
Phytate is the main phosphorous storage form in grains and seeds, but phytate linked phosphorous is inaccessible for fishes. The purpose of this wok was to study the efficacy of Lactococcus lactis subsp. lactis Tw34 for liberating phosphorous in an experimental feed which contained cereal flour. The inoculating bacterium of the biological silage was selected due to its high phytase activity, and the mixtures were prepared with waste hake products (Merluccius hubbsi). Sunflower, corn, wheat and barley flours were mixed with waste ground hake products up to 25% and inoculated with the bacterium mentioned. After 7 days fermentation at 18 oC, the best results were obtained when barley flour was used. The strain was able to reduce the pH value to 4.4 and increase four times the initial concentration of free phosphorous. The results suggest that Lactococcus lactis subsp. lactis Tw34 can increase phosphorous accessibility in cereal flour based diets, avoiding the negative effects of phytic acid on the bioavailability of minerals and proteins, and decreasing the liberation of phosphorous residues.
RESUMEN
Los enterococos son constituyentes de la microflora de quesos artesanales y contribuyen a sus características organolépticas. También producen enterocinas que pueden prevenir el crecimiento de patógenos alimentarios. En este estudio se aislaron 27 cepas de enterococos a partir de leche y queso ovinos provenientes de la Patagonia (Argentina) y se investigó la producción de bacteriocinas. De las 27 cepas aisladas, 22 cepas de Enterococcus faecium y 1 cepa de E. faecalis inhibieron el crecimiento de Listeria innocua ATCC 33090. E. faecium Tw6 mostró la mayor actividad antimicrobiana entre las cepas estudiadas y se seleccionó con el propósito de caracterizar el principio activo y su espectro de inhibición. La tripsina abolió la actividad antilisteria, lo que sugiere que el compuesto activo es de naturaleza proteica; resultó ser estable al calor, resistente al pH y permaneció estable durante más de 12 meses. La masa molecular determinada mediante electroforesis fue aproximadamente de 5,6 KDa. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mostró la presencia de múltiples secuencias de enterocinas (entA, entB, entP y entL50A/B). Las características físico-químicas y bioquímicas de las enterocinas producidas por E. faecium Tw6 las convierten en potenciales candidatas para ser utilizadas en la conservación de alimentos.
Enterococci are part of the microflora of artisan type cheese and contribute to their organoleptic characteristics. They also produce enterocins which can prevent the growth of food pathogens. In this study 27 enterococci strains were isolated from ovine milk and cheese produced at the Argentine Patagonia and they were investigated regarding their bacteriocin production. Of the 27 strains isolated. 22 Enterococcus faecium and one E. faecalis inhibited the growth of Listeria innocua ATCC 33090; E. faecium Tw6 showed the highest antimicrobial activity among the strains studied and it was selected with the purpose of characterizing the active principle and its inhibition spectrum. Trypsin abolished antilisteria activity, which suggests that the active component has a protein nature; it was heat stable, pH resistant, and it remained stable during more than 12 months. The molecular mass determined by electrophoresis was approximately 5.6 KDa. The polymerase chain reaction (PCR) showed the presence of multiple enterocin sequences (entA, entP, and ent50A/B). The physicochemical and biochemical characteristics of the enterocins produced by E. faecium Tw6 identify them as a potential candidates for use in food preservation.
RESUMEN
En el presente trabajo se estudiaron 74 bacterias lácticas para determinar su capacidad de inhibir el desarrollo de Listeria monocytogenes ATCC 7644 o L. innocua ATCC 33090. Dentro de las 7 que exhibieron actividad, 2 se seleccionaron para estudios complementarios y se identificaron por métodos fenotípicos y genotípicos como Enterococcus mundtii Tw 56 y Lactococcus lactis subsp. lactis Tw 34. Después de la neutralización con NaOH y tratamiento térmico (100 ºC y 121 ºC durante 5 min) la actividad antagonista del sobrenadante libre de células se mantuvo activa. El tratamiento con lisozima, lipasa y catalasa no afectó la actividad antimicrobiana. Sin embargo, la actividad enzimática de la tripsina suprimió la acción inhibitoria del sobrenadante, confirmando la naturaleza proteica del compuesto activo. En ambos casos, el título de la actividad antilisteria no se vio afectado luego de la inducción mediada por nisina o galactosa. La combinación de los sobrenadantes libres de células no exhibió antagonismo o sinergia. Las características bioquímicas y fisicoquímicas de los agentes antilisteria producidos por las cepas seleccionadas sugieren que pueden ser clasificadas como bacteriocinas tipo I o II. Se deben realizar estudios complementarios para determinar el uso potencial de las cepas seleccionadas como cultivos bioprotectores en el control de la seguridad alimentaria.
In the present work, 74 strains of lactic bacteria isolated from the marine environment were studied in order to determinate their ability to inhibit the growth of Listeria monocytogenes ATCC 7644 or L. innocua ATCC 33090. Among the 7 strains that exhibited some activity, 2 were selected for further studies and identified by phenotypic and genotypic methods as Enterococcus mundtii Tw 56 y Lactococcus lactis subsp. lactis Tw 34. After neutralization with NaOH and heat treatment (100 ºC and 121 ºC for 5 min) the antagonistic activity of cell-free supernatants of the two strains studied remained active. Treatment with lysozime, lipase and catalase did not affect the antimicrobial activity; however enzymatic activity of trypsin abolished the inhibitory action of the supernatant, confirming the proteinacious nature of the active compound. In both cases, the titre of antilisterial activity was not affected after nisin or galactose-mediated induction. The combination of cell-free supernatants of both strains did not display antagonism or synergy. The biochemical and physicochemical characteristics of antilisterial agents produced by the selected strains suggest that they can be classified as type I or II bacteriocins. Further studies will be adressed to determine the potential use of the selected strains as bioprotective cultures in food safety control.
No presente trabalho foram estudadas 74 bactérias lácticas para determinar sua capacidade de inibir o desenvolvimento de Listeria monocytogenes ATCC 7644 ou L. innocua ATCC 33090. Dentro das 7 que exibiram atividade, 2 foram selecionadas para estudos complementares e se identificaram por métodos fenotípicos e genotípicos como Enterococcus mundtii Tw 56 e Lactococcus lactis subsp. lactis Tw 34. Depois da neutralização com NaOH e tratamento térmico (100 ºC e 121 ºC durante 5 min) a atividade antagonista do sobrenadante livre de células se manteve ativa. O tratamento com lisozima, lipase e catalase não afetou a atividade antimicrobiana. Entretanto, a atividade enzimática da tripsina suprimiu a ação inibidora do sobrenadante, confirmando a natureza proteica do composto ativo. Em ambos os casos, o título da atividade antilisteria não se viu afetado depois da indução mediada por nisina ou galactose. A combinação dos sobrenadantes livres de células não exibiu antagonismo ou sinergia. As características bioquímicas e fisioquimicas dos agentes antilisteria produzidos pelas cepas selecionadas sugerem que podem ser classificadas como bacteriocinas tipo I ou II. Devem ser realizados estudos complementares para determinar o uso potencial das cepas selecionadas como culturas bioprotetoras no controle da segurança alimentar.
Asunto(s)
Bacteriocinas , Enfermedades Transmitidas por los Alimentos , Listeria , Listeria monocytogenes , Ambiente Marino , Antiinfecciosos/análisis , Enfermedades Transmitidas por los Alimentos/microbiología , MicrobiologíaRESUMEN
Los enterococos son utilizados en la industria alimenticia como cultivos iniciadores o probióticos y constituyen contaminantes naturales de los alimentos. Sin embargo, el género Enterococcus ha cobrado relevancia como causal de infecciones nosocomiales, tendencia exacerbada por el desarrollo de resistencia antibiótica. Con el objetivo de estudiar la virulencia potencial de ocho cepas de Enterococcus faecium y de dos cepas de Enterococcus faecalis aislados de quesos ovinos se investigó la resistencia a vancomicina, la actividad hemolítica y la actividad de gelatinasa. En forma adicional se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para determinar la presencia de los genes cylB de la citolisina, gelE de la gelatinasa, cpd de la feromona sexual y agg de la proteína de agregación. Ninguna de las cepas mostró resistencia a la vancomicina o actividad hemolítica. El gen cylB no pudo ser identificado mediante amplificación por PCR en ninguna de las cepas estudiadas. La presencia del gen gelE fue detectada en siete cepas de E. faecium y en una cepa de E. faecalis, sin embargo en ningún caso se detectó actividad de la enzima. El gen cpd fue detectado en E. faecium ETw7 y E. faecalis ETw23, mientras que el gen agg fue hallado en las cepas de E. faecium ETw7 y E. faecalis ETw27. Estos resultados sugieren que la introducción de productos alimenticios o probióticos basados en el uso de cepas de enterococos requiere una cuidadosa evaluación sobre su seguridad.
Enterococci are used as starter and probiotic cultures in the food industry, and they occur as natural food contaminants. However, the genus Enterococcus is of increased significance as a cause of nosocomial infections, exacerbated by the development of antibiotic resistance. In order to study the potential virulence of eight Enterococcus faecium strains and two Enterococcus faecalis strains isolated from ovine cheese, vancomicine resistance, hemolytic activity and gelatinase activity were investigated. In addition, polymerase chain reaction (PCR) tests were carried out in order to determine the presence of cytolicyn gene cylB, gelatinase gene gelE, sex pheromone gene cpd and aggregation protein gene agg. None of the strains showed vancomicine resistance or hemolitic activity. Gene cylB could not be identified by PCR amplification in any of the strains studied. The presence of gene gelE was found in seven E. faecium strains and in one E. faecalis strain, however in no case was gelatinase activity detected. Gene cpd was detected in E. faecium ETw7 and E. faecalis ETw23, while gene agg was found in E. faecium ETw7 and E. faecalis ETw27. These results suggest that the introduction of food products or probiotics based on the use of enterococal strains requires careful safety evaluations.