Antitumoral effects of Amblyomma sculptum Berlese saliva in neuroblastoma cell lines involve cytoskeletal deconstruction and cell cycle arrest / Efeito antitumoral da saliva do carrapato Amblyomma sculptum Berlese em células de neuroblastoma envolve desconstrução do citoesqueleto e parada do ciclo celular

Abstract The antitumor properties of ticks salivary gland extracts or recombinant proteins have been reported recently, but little is known about the antitumor properties of the secreted components of saliva. The goal of this study was to investigate the in vitro effect of the saliva of the hard tick Amblyomma sculptum on neuroblastoma cell lines. SK-N-SK, SH-SY5Y, Be(2)-M17, IMR-32, and CHLA-20 cells were susceptible to saliva, with 80% reduction in their viability compared to untreated controls, as demonstrated by the methylene blue assay. Further investigation using CHLA-20 revealed apoptosis, with approximately 30% of annexin-V positive cells, and G0/G1-phase accumulation (>60%) after treatment with saliva. Mitochondrial membrane potential (Δψm) was slightly, but significantly (p < 0.05), reduced and the actin cytoskeleton was disarranged, as indicated by fluorescent microscopy. The viability of human fibroblast (HFF-1 cells) used as a non-tumoral control decreased by approximately 40%. However, no alterations in cell cycle progression, morphology, and Δψm were observed in these cells. The present work provides new perspectives for the characterization of the molecules present in saliva and their antitumor properties.

Resumo As propriedades antitumorais de extratos de glândulas salivares de carrapatos ou proteínas recombinantes foram relatadas recentemente, mas pouco se sabe sobre as propriedades antitumorais dos componentes secretados da saliva. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito in vitro da saliva bruta do carrapato duro Amblyomma sculptum sobre as linhagens celulares de neuroblastoma. Células SK-N-SK, SH-SY5Y, Be(2)-M17, IMR-32 e CHLA-20 foram suscetíveis à saliva, com redução de 80% na sua viabilidade em comparação com controles não tratados, como demonstrado pelo ensaio de Azul de Metileno. Investigações posteriores utilizando CHLA-20 revelaram apoptose, com aproximadamente 30% de células positivas para anexina-V, e G0/G1 (> 60%) após tratamento com saliva. O potencial de membrana mitocondrial (Δψm) foi reduzido significativamente (p <0,05), e o citoesqueleto de actina foi desestruturado, como indicado pela microscopia de fluorescência. A viabilidade do fibroblasto humano (células HFF-1), usado como controle não tumoral, diminuiu em aproximadamente 40%. No entanto, não foram observadas alterações na progressão do ciclo celular, morfologia e Δψm nestas células. O presente trabalho fornece novas perspectivas para a caracterização das moléculas presentes na saliva e suas propriedades antitumorais.

Quantificação da angiogênese induzida por tumor em membrana corioalantóica de embrião de galinha / Quantification of tumor-induced angiogenesis on chicken embryo chorioallantoic membrane

Angiogênese é um processo de surgimento de novos microvasos provenientes de vasos sanguíneos já existentes. O desenvolvimento tumoral e o processo de metástase são dependentes de angiogênese, pois o tumor em crescimento necessita de uma rede capilar que forneça nutrientes e oxigênio. A membrana corioalantóica de embrião de galinha (CAM) é um modelo experimental in vivo que oferece muitas vantagens, como a alta vascularização natural e alta taxa de reprodução, além de ser um modelo simples e de baixo custo. A CAM é composta por proteínas de matriz extracelular, que mimetizam o ambiente fisiológico de células cancerosas. A etapa de contagem do número total de vasos permite a determinação dos efeitos dos estímulos pró ou anti angiogênicos, portanto a padronização de um método eficaz é necessário. O presente estudo teve como objetivo geral avaliar o potencial angiogênico de células de uma linhagem de adenocarcinoma de cólon humano (HT29) e propor um método para quantificação da angiogênese induzida por células tumorais na CAM. Os embriões foram mantidos em sistema ex ovo. No oitavo dia, foram adicionados sobre a CAM, implantes de colágeno contendo células tumorais em diferentes concentrações. No décimo primeiro dia foi feito o registro fotográfico utilizando microscópio estereoscópico e foram determinados quatro scores para a quantificação e caracterização dos vasos, considerando-se se seccionavam o implante e também seu grau de ramificação. A contagem dos vasos, feita em uma área específica ao redor do implante, foi realizada após edição das imagens pelo programa Image Pro Plus. Os resultados mostraram aumento significativo do número de vasos que não seccionavam o implante para aqueles contendo 3 x 104 e 6 x 104 células. Pode-se concluir que a metodologia de contagem dos vasos, utilizando registros fotográficos e edições de imagens, é eficaz. Demonstrou-se que as células HT29 induzem a uma alteração no padrão de crescimento de novos vasos quando depositada sobre a CAM em implantes de colágeno e podem ser utilizadas como modelo experimental para se investigar o efeito de diferentes compostos sobre a angiogênese induzida por tumor.

Angiogenesis is a process of sprouting of new microvessels from existing blood vessels. The tumoral development and the metastasis process are angiogenesis dependent, because the growing tumor needs a capillaries network that provides nutrients and oxygen. The chicken chorioallantoic membrane (CAM) is an experimental in vivo model which offer many advantages, such as the high natural vascularization and high reproducibility, besides the simplicity and low cost. The CAM contains extracellular matrix proteins, which mimics the physiological cancer cell environment. The counting of the total number of vessels allows a determination of pro- and anti-angiogenic effects of different stimulus, therefore patterning an effective method is necessary. The general goal of the present study was to evaluate the angiogenic potential of a human colon adenocarcinoma cell line (HT29) and propose a method to quantify angiogenesis induced by cancer cells on the CAM. Embryos were cultivated in an ex ovo system. At the eighth day, collagen implants containing cancer cells in different concentrations were added on the top of CAM. At the eleventh day, the photographic records were made by using stereoscope microscope and were determined four scores for vessels quantification and characterization. Vessels counting were done in a specific area around the implant, and edition of the captured images were done using Image Pro Plus software. Our results showed a significant increase in vessels that do not section the implant. It was demonstrated that HT29 cells induce a change in the pattern of growth of new blood vessels when placed on CAM into collagen implants and can be used as an experimental model for investigating the effect of different compounds on tumor-induced angiogenesis.