Implementación de un método molecular para la identificación de Mycoplasma pneumoniae resistente a macrólidos / Implementation of a molecular method for the detection of macrolide-resistant Mycoplasma pneumoniae

Introducción: Mycoplasma pneumoniae es causa frecuente de infecciones respiratorias en niños y jóvenes. Los macrólidos son la primera línea de tratamiento. La rápida emergencia de resistencia a estos antimicrobianos ha motivado el desarrollo de métodos moleculares para su detección en muestras clínicas positivas a este patógeno. Objetivo: Implementar un método de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para la detección de resistencia a macrólidos a partir de muestras clínicas positivas a M. pneumoniae. Métodos: Se implementó una RT-PCR para la detección de las mutaciones A2058G y A2059G en el ARNr 23S de M. pneumoniae. Se analizaron 24 muestras clínicas positivas a M. pneumoniae, que provenían de pacientes con síntomas respiratorios. Se evaluó la sensibilidad, especificidad, repetibilidad y reproducibilidad de la RT-PCR. Resultados: La RT-PCR mostró un 100 % de especificidad para M. pneumoniae y un 92 % de sensibilidad, con un límite de detección de 2 copias/µL, que equivale a 10 copias/reacción. Además, se demostró la reproducibilidad y repetibilidad de estos resultados. Se obtuvo una correcta identificación de los genotipos salvaje y mutante, correspondientes a cada control. De las muestras clínicas positivas a M. pneumoniae, el 77,3 % (17/22) se identificó como sensible a macrólidos y el 22,7 % (5/22) como resistente. Conclusiones: La alta sensibilidad y especificidad del método de RT-PCR implementado permite que el Laboratorio Nacional de Referencia de Micoplasmas del Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí cuente con un método eficaz para el diagnóstico de M. pneumoniae resistente a macrólidos.

Introduction: Mycoplasma pneumoniae is a common cause of respiratory track infections in children and young adults. Macrolides are the first-line treatment. The rapid emergence of resistance to these antimicrobials has motivated the development of molecular methods for their detection in clinical samples positive for this pathogen. Objective: To implement a real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) method for the detection of macrolide resistance in M. pneumoniae positive clinical samples. Methods: An RT-PCR was implemented to detect mutations A2058G and A2059G in 23S rRNA of M. pneumoniae. M. pneumoniae positive clinical samples from 24 patients with respiratory symptoms were analyzed. Sensitivity, specificity, repeatability and reproducibility of the RT-PCR assays were evaluated. Results: The RT-PCR assays showed 100% specificity to M. pneumoniae, and 92% sensitivity with a detection limit of 2 copies/µL, equivalent to 10 copies/reaction. Moreover, the repeatability and reproducibility of these results were demonstrated. Wild and mutant genotypes associated to each control were properly identified. Of the clinical samples positive for M. pneumoniae, 77.3% (17/22) were macrolide-sensitive and 22.7% (5/22) were macrolide-resistant. Conclusions: The high sensitivity and specificity of the RT-PCR method implemented provides the National Reference Laboratory of Mycoplasmas of the Institute of Tropical Medicine Pedro Kourí with an effective method for the diagnosis of macrolide-resistant M. pneumoniae.

Design and analytical validation of a duplex PCR for Ehrlichia and Rickettsia detection in ticks / Diseño y validación analítica de una PCR dúplex para la detección de Ehrlichia y Rickettsia en garrapatas / Projeto e validação analítica de uma PCR duplex para detecção de Ehrlichia e Rickettsia em carrapatos

Abstract Background: Ehrlichia and Rickettsia are two major rickettsial genera transmitted by ticks that affect a number of wild and domestic animal species and human populations around the world. Objective: To design and validate a duplex PCR for Ehrlichia and Rickettsia in ticks. Methods: Assay validation included testing for sensitivity, specificity, reproducibility, and robustness of the PCR. The groEL and 23sr RNA genes were used for Ehrlichia and Rickettsia, respectively. Results: The limit of detection was one hundred gene copies per 50 μL of reaction for Ehrlichia spp, and one gene copy of Rickettsia per 50 μL of reaction. In general, the primers of the test only amplified in silico those bacterial agents for which they were originally designed, with the exception of the primers for Rickettsia that also amplified Methylocystis sp. The test was reproducible (intermediate precision) 96.7% of the times for both agents. The test was robust enough to tolerate concentration changes of all reagents with the exception of Taq DNA polymerase. Conclusions: The validation results indicated that this PCR is useful for detection in both bacterial genera and it is a good candidate for diagnostic validation.

Resumen Antecedentes: Ehrlichia spp. y Rickettsia spp. son dos de los principales géneros rickettsiales transmitidos por garrapatas que afectan a animales silvestres, domésticos y humanos alrededor del mundo. Objetivo: Diseñar y validar una prueba PCR dúplex para Ehrlichia y Rickettsia en garrapatas. Métodos: La validación de la prueba incluyó ensayos de sensibilidad, especificidad, reproducibilidad y robustez. En la PCR se usó groEL y ARNr 23S como genes blanco para Ehrlichia y Rickettsia, respectivamente. Resultados: El límite de detección fue de 100 copias del gen por 50 μL de reacción para Ehrlichia spp y una copia del gen de Rickettsia por 50 μL de reacción. En general, los cebadores de la prueba solo amplificaron in silico los agentes bacterianos para los cuales fueron originalmente diseñados, con la excepción de los cebadores de Rickettsia que también amplificaron Methylocystis sp. La prueba fue reproducible (precisión intermedia) en un 96.7% de las veces para ambos agentes. La prueba fue suficientemente robusta como para tolerar cambios de concentración de los diferentes reactivos, con excepción de la Taq DNA polimerasa. Conclusión: Los resultados de validación indican que la PCR es útil para detectar ambos géneros bacterianos y podria usarse para validación diagnostica.

Resumo Antecedentes: Ehrlichia e Rickettsia são dois dos principais gêneros de rickettsias transmitidos por carrapatos que infectam tanto animais selvagens quanto animais domésticos e até homens em todo o mundo. Objetivo: O objetivo principal foi elaborar e validar uma PCR duplex para Ehrlichia e Rickettsia em carrapatos. Métodos: A validação incluiu testes de sensibilidade, especificidade, reprodução e robustez. Para o PCR, utilizamos os genes groEl e 23Sr-RNA para Ehrlichia e Rickettsia, respectivamente. Resultados: O limite de detecção foi de 100 cópias de genes por 50 ml de reação para Erliquia spp e uma cópia de gene de Rickettsia por 50 ml de reação. Em geral, os iniciadores dos testes amplificaram em modelos computacionais os agentes bacterianos para os quais eles foram projetados, exceto os primers de Rickettsia que também amplificou Methylocystis sp. Os testes foram reproduzíveis (precisão intermediária) 96,7% para ambos os agentes e foram também robustos para tolerar mudanças de concentração em todos os reagentes, exceto o reagente Taq DNA polymerase. Conclusões: Os resultados da validação indicaram que o PCR é útil para detecção em ambos os gêneros bacterianos, portanto, um bom exame para validação diagnóstica.