Antibiotic microbial assay using kinetic-reading microplate system / Ensaio microbiano antibiótico utilizando cinética de leitura de microplacas sistema

The aim of this study was to determine the optimal experimental conditions to develop a methodology for microbiological assay of apramycin employing microplate and kinetic reading mode, and to validate the developed method, through evaluation of parameters of selectivity, linearity, linear range, limits of detection and quantification, accuracy and precision. The turbidimetric assay principle is simple: the test solution is added to a suspension of test microorganism in culture media, the mixture is incubated under appropriate conditions and the microbial growth is measured by photometric reading. Microplate with kinetic reading mode employed in antibiotic assay is of considerable interest since it allows reduction of material and analysis time and enables a large number of samples to be analyzed simultaneously, with automated reading and calculating. Established conditions considered the standard-curve of apramycin at concentrations from 5.0 to 35.0 μg mL-1, and tryptic soy broth inoculated with 5 percent Escherichia coli (ATCC 8739) suspension. Satisfactory results were obtained with 2 hours of incubation. The developed method showed appropriate selectivity, linearity in the range from 5.0 to 35.0 μg mL-1, limits of detection and quantification of 0.1 and 0.4 μg mL-1, respectively, as well as satisfactory accuracy (recuperation = 98.5 percent) and precision (RSD = 6.0 percent). Microplate assay combined the characteristics of microbiological (evaluation of antibiotic activity against sensitive test microorganism) and physico-chemical (operationally straightforward and faster results) assays.

O objetivo deste trabalho é determinar as condições experimentais ideais para o desenvolvimento de metodologia para a dosagem microbiológica de apramicina empregando microplacas e modo de leitura cinético e validar o método desenvolvido, através da avaliação dos parâmetros de especificidade e seletividade, linearidade, faixa ou intervalo linear, limite de detecção e quantificação, exatidão e precisão. O ensaio turbidimétrico é simples: a solução-teste é adicionada à suspensão de microrganismo-teste em meio de cultura, a mistura é incubada em condições apropriadas e o crescimento microbiano é medido por meio de leitura fotométrica. O emprego de método de microplacas com leitura cínética para a dosagem de antibióticos é de interesse considerável, uma vez que possibilita reduzir quantidade de material e tempo de análise necessários e permite o ensaio de grande número de amostras simultaneamente, com leitura e cálculo automatizados. As condições estabelecidas abrangem curva-padrão de apramicina com concentrações entre 5 e 35 μg/mL, e emprego de meio de cultura caldo de triptona-soja inoculado com Escherichia coli (ATCC 8739) na proporção de 5 por cento. Foram obtidos resultados satisfatórios após 2 horas de incubação. O método desenvolvido apresentou especificidade e seletividade adequadas, linearidade na faixa de 5 a 35 μg/mL, limite de detecção e quantificação de 0,1 e 0,4 μg/mL, respectivamente, exatidão (recuperação = 98,5 por cento) e precisão (DPR = 6,0 por cento) satisfatórias. O ensaio em microplaca agrega características dos ensaios microbiológicos (avaliação da atividade do antibiótico frente a microrganismo-teste sensível) e físico-químicos (facilidade operacional e maior rapidez na obtenção dos resultados).

Determination of apramycin in oral soluble powder by a HPLC method using pre-column derivatization with o-phthalaldehyde and UV detection / Determinação da apramicina em pó solúvel oral por um método de HPLC utilizando pré-coluna de derivação com o de detecção de ftalaldeído e UV

A high-performance liquid chromatographic method employing pre-column derivatization with o-phthalaldehyde (OPA) and 2-mercaptoacetic acid was developed for the determination of apramycin, an aminoglycoside antibiotic used in veterinary medicine, in the oral soluble powder form. The chromatographic separation was done by ion-pair HPLC using a C18 reversed-phase column, Synergy Hydro (150 mm x 4.6 mm x 4 µm) and mobile phase composed of 0.005 mol/L sodium octanosulfonate in a mixture of acetonitrile: water: acetic acid (45:55:2) (v/v/v) with a flow rate of 1.0 mL/min; the UV detector was operated at 332 nm. The developed method was validated according to official compendia guidelines, having demonstrated robustness, selectivity and linearity for the concentration range of 0.02 to 0.05 mg/mL, precision (with RSD < 2.0 percent both for intra and inter-day precision) accuracy (average recuperation of 99.33 percent) and detectivity (quantification and detection limits of 0.08 and 0.02 µg/mL, respectively). Three batches of commercial apramycin oral soluble powder were analyzed by both the proposed method and the official microbiological method, where all the results obtained were in the acceptable range (95 percent to 105 percent of labeled value of apramycin). Both methods were statistically compared by the t test, which yielded no significant differences (α = 0.05) thereby confirming the equivalence of the methods.

Foi desenvolvido um método por cromatografia líquida alta eficiência empregando derivatização pré-coluna com o-ftalaldeído (OPA) e ácido mercaptoacético para determinação de apramicina, um antibiótico aminoglicosídeo de uso veterinário, em pó oral solúvel. A separação cromatográfica foi feita por fase reversa com pareamento iônico utilizando-se coluna Synergy Hydro C18 (150 x 4,6 mm x 4 µm) e fase móvel composta por octanossulfonato de sódio 0,005 mol/L em mistura de acetonitrila:água:ácido acético nas proporções 45:55:2 (v/v/v), numa vazão de 1.0 mL/min; efetuou-se detecção por UV a 332 nm. O método foi validado de acordo com os compêndios oficiais e demonstrou robustez, seletividade, linearidade na faixa de 0,02 a 0,05 mg/mL, precisão (com DPR < 2,0 por cento tanto para a precisão intra-dia quanto para a precisão inter-dia), exatidão (recuperação média de 99,33 por cento) e detectabilidade (limite de quantificação e de detecção iguais a 0,08 e 0,02 µg/mL, respectivamente). Analisaram-se 3 lotes de apramicina pó oral solúvel pelo método proposto e pelo método microbiológico oficial e todos os resultados obtidos estavam dentro do limite de aceitação (95 por cento-105 por cento valor rotulado de apramicina). Ambos os métodos foram comparados estatisticamente pelo teste t, não sendo encontradas diferenças significativas entre eles para α=0,05, sendo os dois equivalentes.