Identification and biological characterization of pathogen causing black spot of Pseudostellaria heterophylla in Fujian province / 中国中药杂志

In Zherong county, Fujian province, the black spot of Pseudostellaria heterophylla often breaks out in the rainy season from April to June every year. As one of the main leaf diseases of P. heterophylla, black spot seriously affects the yield and quality of the medicinal material. To identify and characterize the pathogens causing black spot, we isolated the pathogens, identified them as a species of Alternaria according to Koch's postulates, and then tested their pathogenicity and biological characteristics. The results showed that the pathogens causing P. heterophylla black spot were A. gaisen, as evidenced by the similar colony morphology, spore characteristics, sporulation phenotype, and the same clade with A. gaisen on the phylogenetic tree(the maximum likelihood support rate of 100% and the Bayesian posterior probability of 1.00) built based on the tandem sequences of ITS, tef1, gapdh, endoPG, Alta1, OPA10-2, and KOG1077. The optimum conditions for mycelial growth of the pathogen were 25 ℃, pH 5-8, and 24 h dark culture. The lethal conditions for mycelia and spores were both treatment at 50 ℃ for 10 min. We reported for the first time the A. gaisen-caused black spot of P. heterophylla. The results could provide a theoretical basis for the diagnosis and control of P. heterophylla leaf spot diseases.

Occurrence of citrus brown and black spot diseases and their control using pre-harvest approaches

Mild brown and black spot diseases symptoms were detected on citrus varieties, Valencia and Navel fruits during season 2018 in some citrus orchards at North Egypt. Collected diseased fruit samples revealed isolation of Alternaria alternata and Phyllosticta citricarpa (McAlpine) van der Aa. Some organic acids, salts and Saccharomyces cerevisiae were evaluated against the diseases incidents in vitro and in vivo. Complete growth inhibition was recorded for fungi tested at 2g/L of salicylic acid, Potassium dihydrogen phosphate, Tri-Sodium polyphosphate and 2.5 g/L of S. cerevisiae. All pre-harvest treated Valencia trees, inoculated fruits revealed no diseases symptoms up to 10 days of storage period. Meanwhile, S. cerevisiae and salicylic acid treatments had extended protective effect up to 20 days. Control strategy through spraying Valencia orange trees with yeast or some organic acids and salts as pre-harvest approaches should be taken in consideration especially these diseases began to occur in North region of Egypt.

Identification, biological characteristics, and fungicide screening of pathogen of black spot in Aconitum carmichaelii / 中国中药杂志

In Hezhang county, Guizhou province, black spot tends to occur to Aconitum carmichaelii in the hot rainy summer, with the incidence up to 50%-70%, seriously impacting the yield and quality of the medicinal material. Thus, this study aims to clarify the pathogen and the occurrence characteristics. To be specific, the pathogen was isolated and identified according to Koch's postulates and the pathogenicity and biological characteristics were determined. In addition, the sensitivity of the pathogen to four microbial fungicides, four botanical fungicides, and five chemical fungicides was determined with the mycelium growth rate method for the purpose of screening out optimal fungicides. The pathogen was identified as Alternaria alternate, as evidenced by the similar colony morphology and microscopic characteristics and 99.55%-100% similarity in sequences of rDNA-ITS, LSU, 18S, and TEF of the two. The optimum growth conditions for A. alternata were 28 ℃, pH 8, and continuous darkness. Bacillus subtilis had strong inhibitory effect on the pathogen, and the inhibition rate was more than 90% when the concentration was 1 mg·L~(-1). In addition, difenoconazole and quinoline copper can also control the pathogen, with median effective concentration(EC_(50)) of 2.92 and 9.02 mg·L~(-1), respectively. This study lays a theoretical basis for the field control of black spot in A. carmichaelii.

Morphological characterization and molecular identification of Colletotrichum species associated to sweet persimmon anthracnose in Southern Brazil / Caracterização morfológica e identificação molecular de espécies de Colletotrichum associadas à antracnose de caqui doce no Sul do Brasil

ABSTRACT: The highlands of Southern Brazil contribute with 40% of Brazilian persimmon production. Although expanding, persimmon production faces major problems caused by anthracnose disease (black spot), including fruit rot and necrosis of leaves. Several Colletotrichum species (C. horii, C. gloeosporioides, among others) are implicated in persimmon anthracnose around the world. To identify Colletotrichum species associated with persimmon anthracnose in the highlands of Southern Brazil, 34 isolates were analyzed by ITS-rDNA partial region, GAPDH, and TUB2 partial gene sequences, morphological characteristics, and virulence on persimmon fruits and leaves. Data showed a high prevalence of C. horii (85.3%), that associated with its high virulence on fruits and leaves, confirm a considerable degree of host preference. Moreover, other species C. aenigma, C. asianum, C. fructicola, and C. nymphaeae, were identified, but the last three ones exhibited low virulence on fruits and were not able to produce symptoms on leaves. As far as we know this is the first reference on C. asianum in persimmon. The present data may contribute to a better understanding of the etiology of anthracnose in sweet persimmon in Southern Brazil, and it will be useful for epidemiological studies and the development of disease management measures.

RESUMO: As terras altas do sul do Brasil contribuem com 40% da produção brasileira de caqui. Embora em expansão, a produção de caqui enfrenta grandes problemas causados ​​pela antracnose (mancha preta), incluindo o apodrecimento dos frutos e necrose das folhas. Várias espécies de Colletotrichum (C. horii, C. gloeosporioides, entre outras) estão envolvidas com a antracnose do caqui em todo mundo. Para identificar espécies de Colletotrichum associadas à antracnose de caqui nas terras altas do sul do Brasil, 34 isolados foram analisados ​​através da região parcial de ITS-rDNA e sequências parciais dos genes GAPDH e TUB2, características morfológicas e virulência em frutos e folhas de caqui. Os dados mostraram uma alta prevalência de C. horii (85,3%), que associada à sua alta virulência em frutos e folhas, confirma um grau considerável de preferência pelo hospedeiro. Além disso, foram identificadas outras espécies C. aenigma, C. asianum, C. fructicola, e C. nymphaeae, mas as três últimas exibiram baixa virulência nos frutos e não foram capazes de produzir sintomas nas folhas. Até onde sabemos, esta é a primeira referência sobre C. asianum em caqui. Os presentes dados podem contribuir para uma melhor compreensão da etiologia da antracnose em caqui doce no sul do Brasil e isso pode ser útil para estudos epidemiológicos e para o desenvolvimento de medidas de controle da doença.

Phylogeographic distribution of asperisporium caricae isolates in brazilian southeastern and northeastern coastal regions / Distribuição filogeográfica de isolados de Asperisporium caricae no litoral do sudeste e nordeste brasileiro

Papaya (Carica papaya L.) is one of the main tropical fruits consumed in Brazil. The country is also one of the main papaya exporters, but one of the factors hindering its production lies on foliar diseases such as papaya black spot, which is caused by fungus Asperisporium caricae. This pathogen is widely distributed in the main producing regions of the Brazilian coastal area. Phylogeographic studies contribute to the knowledge about the genetic diversity and geographical distribution of genealogical lineages (haplotypes) and help better understanding the reproductive and evolutionary processes of closely related species or of a single species. Such information is useful in studies about phytopathogenic fungi because it enables identifying the most prevalent genealogical lineages in a given location, as well as inferring dispersal routes and providing information on the origin and frequency of exotic material introduction events. Results in this type of study can significantly help developing new disease control strategies. Literature still lacks studies on the Papaya x A. caricae pathosystem. Based on the phylogenetic and phylogeographic analysis applied to nucleotide sequences of the Internal transcribed spacer (ITS) gene, we herein address the genealogical and dispersal events recorded for this pathogen in order to better understand its evolution in, and adaptation to, Brazilian orchards. Three haplotypes were identified among the A. caricae isolates; their distribution was mostly related to the geographic distance between sample collection regions rather than to any reproductive or evolutionary processes presented by the species. The low variability among the herein studied isolates may result from the physiological specialization (survival exclusively associated with the host plant) and from the regional transport of contaminated fruits (with lesions and spores), besides the low contribution of reproductive events, which corroborate the lack of knowledge about the sexual stages of A. caricae.

O mamoeiro (Carica papaya L.), é uma das principais frutas tropicais consumidas no Brasil. O país é um dos principais exportadores de mamão e um dos gargalos da produção mundial está diretamente ligado à ocorrência de doenças foliares, podendo-se destacar a pinta-preta do mamoeiro, causada pelo fungo Asperisporium caricae. O patógeno está amplamente distribuído nas principais regiões produtoras, as quais englobam grande parte do litoral Brasileiro. Estudos filogeográficos contribuem não só para oconhecimento da diversidade genética e da distribuição geográfica das linhagens genealógicas (haplótipos), como também contribuem para o conhecimento dos processos reprodutivos e evolutivos de uma espécie ou de espécies estreitamente relacionadas. No estudo de fungos fitopatogênicos, tais informações são úteis para identificar linhagens genealógicas mais prevalentes em um determinado local, inferir as rotas de dispersão e fornecer informações sobre a origem e frequência dos eventos de introdução de material exótico. Este tipo de estudo produz resultados que podem colaborar significativamente na elaboração de novas estratégias de controle da doença. Não existe, até o presente momento, este tipo de estudo para o patossistema Mamoeiro x A. caricae. Neste trabalho, por meio da análise filogenética e filogeográfica, a partir de sequências nucleotídicas do gene Internal transcribed spacer (ITS), discutimos os eventos genealógicos e de dispersão deste patógeno com o intuito de compreender melhor sua evolução e adaptação nos pomares brasileiros. Dentre os isolados de A. caricae foram identificados 3 haplótipos, sendo sua distribuição relacionada mais ao distanciamento geográfico das regiões das coletas das amostras do que a eventuais processos reprodutivos ou evolutivos da espécie. Acredita-se que a baixa variabilidade dentre os isolados estudados seja explicada pela especialização fisiológica (sobrevivência exclusivamente associada à planta hospedeira) e ao transporte regional de frutos contaminados (com lesões e esporos), sendo baixa a contribuição de eventos reprodutivos, o que corrobora o desconhecimento de fase sexual de A. caricae.

First Report of Black Spot Disease Caused by Alternaria alternata on Sweet Persimmon Fruits

Black spot of sweet persimmon, caused by Alternaria alternata, occurred in an orchard in Gyeongnam province, Korea in 2012. The symptom was appearance of 0.5 to 4 cm black spots on the surface of fruit. The pathogen was isolated from flesh of disease lesions. The causal agent was identified as A. alternata by morphological characteristics and sequencers of the internal transcribed spacer (ITS) 1 and ITS4 regions of rRNA. Artificial inoculation of the pathogen resulted in development of disease symptoms and the re-isolated pathogen showed characteristics of A. alternata.

High molecular diversity of the fungus Guignardia citricarpa and Guignardia mangiferae and new primers for the diagnosis of the citrus black spot

RAPD markers were used to investigate the distribution of genetic variability among a group of Guignardia citricarpa, G. mangiferae, and Phyllosticta spinarum isolates obtained from several hosts in Brazil, Argentina, Mexico, Costa Rica, Thailand, Japan, United States and South Africa. Pathogenic isolates G. citricarpa Kiely (anamorph form P. citricarpa McAlp Van Der Aa) are the etiological agent of the Citrus Black Spot (CBS), a disease that affects several citric plants and causes substantial injuries to the appearance of their fruits, thus preventing their export. Several previous studies have demonstrated the existence of an endophytic species with high morphological similarity to the causal agent of CBS that could remain latent in the same hosts. Consequently, the identification of the plants and fruits free from the causal agent of the disease is severely hampered. The RAPD analysis showed a clear discrimination among the pathogenic isolates of G. citricarpa and endophytic isolates (G. mangiferae and P. spinarum). In addition, a Principal Coordinate Analysis (PCO) based on a matrix of genetic similarity estimated by the RAPD markers showed four clusters, irrespective of their host or geographical origin. An Analysis of Molecular Variance (AMOVA) indicated that 62.8 percent of the genetic variation was found between the populations (G. citricarpa, G. mangiferae, P. spinarum and Phyllosticta sp.). Substantial variation was found in the populations (37.2 percent). Exclusive RAPD markers of isolates of G. citricarpa were cloned, sequenced and used to obtain SCARS (Sequence Characterized Amplified Regions), which allowed the development of new specific primers for the identification of G. citricarpa PCR (Polymerase Chain Reaction) analysis using a pair of primers specific to pathogenic isolates corroborating the groupings obtained by the RAPD markers, underscoring its efficiency in the identification of the causal agent of CBS.

Marcadores de RAPD foram utilizados para investigar a distribuição da variabilidade genética de linhagens de Guignardia citricarpa, G. mangiferae, e Phyllosticta spinarum isolados em diversos hospedeiros no Brasil, Argentina, México, Costa Rica, Tailândia, Japão, EUA e África do Sul. O fungo Guignardia citricarpa Kiely (Phyllosticta citricarpa McAlp Van Der Aa) é o agente causal da Mancha Preta dos Citros (CBS), uma doença que afeta diversas plantas cítricas, causando dano a aparência dos frutos, prejudicando a exportação. Diversos estudos têm demonstrado a existência de uma espécie endofítica muito semelhante morfologicamente a G. citricarpa, e que permanece de forma endofítica no mesmo hospedeiro. Dificultando assim, a identificação de plantas e frutos livres do agente causa da CBS. A análise do perfil de RAPD revelou uma clara discriminação entre isolados patogênicos de G. citricarpa e isolados endofíticos (G. mangiferae e P. spinarum). A Análise de Coordenadas Principais (PCO) baseada na matriz de similaridade genética dos marcadores RAPD, demonstrou a formação de quatro grupos, sem relação com origem geográfica ou com hospedeiros utilizados. A análise de Variância de Marcadores Moleculares (AMOVA) indicou que 62,8 por cento da variação genética é encontrada entre as populações (G. citricarpa, G. mangiferae, P. spinarum and Phyllosticta sp.). Entretanto, variação substancial foi encontrada dentro destas populações (37,2 por cento). Bandas de RAPD exclusivas de isolados de G. citricarpa foram clonadas, sequenciadas e utilizadas na obtenção de SCARS (Sequence Characterized Amplified Regions), que permitiram o desenvolvimento de novos primers específicos para a identificação de G. citricarpa. Reações de PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando este par de primers corroboraram os agrupamentos obtidos pelos marcadores de RAPD, revelando sua eficiência na identificação do agente causal da CBS.

Chitosan reduces infection by Guignardia citricarpa in postharvest 'Valencia' oranges

Citrus fruits are affected by the black spot disease caused by Guignardia citricarpa. Resistance induction is an alternative control measure and chitosan exhibits potential as resistance inducer. The effect of chitosan on G. citricarpa was evaluated in vitro and in 'Valencia' oranges. Citrus fruit were immersed into different chitosan concentrations. Chitosan (2 percent), combined with or without thiabendazole and the citric acid was also investigated. All the chitosan concentrations inhibited G. citricarpa mycelial growth and affected morphologically the conidial germination and appressorium formation. Chitosan inhibited the development of new lesions in oranges at room condition or under refrigeration. Thiabendazole and citric acid did not reduce the formation of lesions. Biochemical analysis revealed that chitinase, β-1,3-glucanase, peroxidase and polyphenoloxidase activities were increased in chitosan-treated fruits. Thus, the effect of chitosan on the reduction of black spots in 'Valencia' oranges could be due to the germicidal effect on the pathogen and/or resistance induction in the fruit.

Frutos cítricos são afetados pela mancha preta dos citros, causada por Guignardia citricarpa.A indução de resistência é uma alternativa de controle e a quitosana exibe potencial como indutor de resistência. O efeito da quitosana sobre G. citricarpa foi avaliado in vitro e em laranjas 'Valência'. Frutos cítricos foram imersos em diferentes concentrações de quitosana. Quitosana (2 por cento), associada ou não com tiabendazol e ácido cítrico, foi também avaliada. Todas as concentrações de quitosana inibiram o crescimento micelial de G. citricarpa e afetaram morfologicamente a germinação dos conídios e a formação de apressórios. Quitosana inibiu o desenvolvimento de novas lesões em laranjas em condições ambiente e sob refrigeração. Tiabendazol e ácido cítrico não reduziram o aparecimento de novas lesões. Análises bioquímicas revelaram que atividades de quitinase, β-1,3-glucanase, peroxidase e polifenoloxidase aumentaram em frutos tratados com quitosana. Portanto, a capacidade da quitosana na redução da mancha preta em laranja 'Valência' pode ser devida ao efeito germicida sobre o patógeno e/ou a indução de resistência no tecido do fruto.

Fungicide resistance and genetic variability in plant pathogenic strains of Guignardia citricarpa / Resistência a fungicidas e variabilidade genética em linhagens patogênicas de plantas Guignardiacitricarpa

Citrus black spot (CBS) is a plant disease of worldwide occurrence, affecting crops in Africa, Oceania, and South America. In Brazil, climate provides favorable conditions and CBS has spread to the Southeast and South regions. CBS is caused by the fungus Guignardia citricarpa (anamorph: Phyllosticta citricarpa) and its control is based on the use of fungicides, such as benzimidazoles. In South Africa, the disease was kept under control for 10 years with benomyl, until cases of resistance to high concentrations of this fungicide were reported from all citrus-producing areas. Azoxystrobin (a strobilurin) has been found effective in controlling phytopathogens, including CBS, in a wide range of economically important crops. The present study investigated in vitro the effects of the fungicides benomyl and azoxystrobin on 10 strains of G. citricarpa isolated from lesions in citrus plants from Brazil and South Africa. Benomyl at 0.5 µg/mL inhibited mycelial growth in all strains except PC3C, of African origin, which exhibited resistance to concentrations of up to 100.0 µg/mL. The spontaneous mutation frequency for resistance to benomyl was 1.25 ï 10-7. Azoxystrobin, even at high concentrations, did not inhibit mycelial growth in any of the strains, but significantly reduced sporulation rates, by as much as 100%, at a concentration of 5.0 µg/mL. Variations in sensitivity across strains, particularly to the strobilurin azoxystrobin, are possibly related to genetic variability in G. citricarpa isolates.

A Mancha Preta dos Citros (MPC) tem ocorrência mundial afetando a produção de citros na África, Oceania e América do Sul. No Brasil, onde o clima é favorável ao seu desenvolvimento, a doença está espalhada nas regiões Sul e Sudeste. O controle da MPC, causada pelo fungo Guignardia citricarpa (anamorfo: Phyllosticta citricarpa) é baseado na aplicação de fungicidas, como os benzimidazóis. Na África do Sul, após 10 anos de controle da doença com o fungicida benomil, os casos de resistência a altas concentrações deste fungicida atingiram todas as áreas produtoras. O fungicida estrolilurina chamado azoxistrobina tem se mostrado eficiente no controle dos fitopatógenos de uma grande variedade de culturas economicamente importantes, incluindo a MPC. Neste trabalho foram investigados os efeitos in vitro dos fungicidas benomil e azoxistrobina em 10 linhagens de G. citricarpa isoladas de lesões em plantas cítricas no Brasil e na África do Sul. Houve inibição do crescimento micelial a 0,5 µg/mL do fungicida benomil entre as linhagens testadas, com exceção de PC3C de origem sul-africana, que apresentou resistência até a concentração de 100,0 µg/mL de benomil. A freqüência de mutação espontânea para resistência ao benomil foi de 1,25 ï 10-7. A estrobilurina azoxistrobina, mesmo em altas concentrações, não inibiu o crescimento micelial dos isolados, entretanto reduziu significativamente a produção de esporos, chegando a 100% de inibição em concentrações de 5,0 µg/mL de azoxistrobina. A variação na sensibilidade das linhagens, principalmente com a estrobilurina azoxistrobina, possivelmente está relacionada com a variabilidade genética dos isolados de G. citricarpa.

Mechanisms and significance of fungicide resistance / Mecanismos e significância da resistência a fungicidas

In this review article, we show that occurrence of fungicide resistance is one of the most important issues in modern agriculture. Fungicide resistance may be due to mutations of genes encoding fungicide targets (qualitative fungicide resistance) or to different mechanisms that are induced by sub-lethal fungicide stress. These mechanisms result in different and varying levels of resistance (quantitative fungicide resistance). We discuss whether or not extensive use of fungicides in agricultural environments is related to the occurrence of fungicide resistance in clinical environments. Furthermore, we provide recommendations of how development of fungicide resistant pathogen populations may be prevented or delayed.

A ocorrência de resistência a fungicidas é uma das mais importantes conseqüências da agricultura moderna. Este fato pode ser resultado de mutações em genes codificadores de resistência a fungicidas (resistência quantitativa) ou a diferentes mecanismos que são induzidos por stresse devido a doses subletais dos produtos utilizados. Estes mecanismos produzem diferentes e variados níveis de resistência (resistência quantitativa). Também é discutido se o uso extensivo de fungicidas em ambientes agricultáveis é relacionado ou não com a ocorrência de resistência em ambientes clínicos. Além disso, também são fornecidas recomendações de como prevenir ou mesmo retardar o desenvolvimento de resistência a fungicidas em patógenos.