Caracterização clínica, molecular e genética de pacientes com câncer colorretal abaixo de 50 anos / Clinical, molecular and genetic characterization of colorectal cancer patients under 50 years of age

Introdução: Pacientes com câncer colorretal (CCR) em idade jovem (< 50 anos) apresentam maior risco de apresentar variantes germinativas em genes de predisposição ao câncer, entre eles os genes da Síndrome de Lynch (SL) (genes MMR - MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2). Detectar a perda de expressão de proteínas de reparo de incompatibilidade de DNA (MMR) é altamente relevante para identificar pacientes com síndrome de Lynch. No entanto, a inativação de MLH1 devido à hipermetilação do promotor ocorre em 15% dos cânceres colorretais (CCRs) esporádicos e está correlacionada com mutações somáticas BRAF. Ainda, apesar das principais síndromes hereditárias de CCR representarem 15-19% dos casos de CCR de início precoce, a etiologia da maior parte dos CCRs nestes pacientes é desconhecida, mesmo com até 25% destes casos apresentando história familiar importante para essa neoplasia. Objetivo: Caracterizar o fenótipo clínico e molecular (somático e germinativo) de pacientes com CCR desenvolvido antes dos 50 anos tratados no A.C.Camargo Cancer Center. Materiais e Métodos: Pacientes com câncer colorretal <50 anos foram selecionados a partir do banco de dados do Departamento de Cirurgia Pélvica ou pelo encaminhamento do Departamento de Oncogenética. A análise de metilação do promotor de MLH1 foi realizada por sequenciamento de nova geração (NGS) a partir de DNA convertido por bissulfito de sódio, em uma metodologia desenvolvida e validada nesse estudo. A análise de mutação de BRAF foi realizada por NGS de amplicon. Para um subgrupo de pacientes com critérios clínicos e moleculares específicos (tumores MMR deficientes, história familiar positiva para CCR, mutação KRAS: G12C e/ou idade <40 anos) foi realizado o sequenciamento germinativo de genes de predisposição ao CCR. Na avaliação das variantes germinativas foi utilizado um painel multigênico com 62 genes de associação conhecida, emergente ou desconhecida para predisposição ao CCR. As variantes identificadas foram classificadas segundo os critérios sugeridos pelo American College of Medical Genetics (ACMG). Resultados: Para análise de metilação de MLH1 utilizamos DNA de tumores FFPE e saliva foi tratado com bissulfito, amplificado por PCR e avaliado por NGS. Em tumores deficientes em MLH1/PMS2, o estado de metilação de MLH1 foi concordante com o estado de mutação BRAF em 90% (18/20) dos casos. Nosso teste NGS baseado em amplicon mostrou uma grande sensibilidade e especificidade para detectar a metilação de MLH1 em amostras de CCR, com alta concordância com a avaliação da mutação BRAF. A avaliação das variantes germinativas foi realizada em 89 pacientes, e identificamos 24 (27%) pacientes com variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas (P/PP). A maioria dos pacientes 53% (47/89) apresentaram variantes de significado incerto (VUS) e 18 (20%) pacientes apresentaram apenas variantes sem significado clínico para os 62 genes avaliados. Dos 24 pacientes com variantes patogênicas, 16 (66,6%) apresentaram variantes P/PP em genes da síndrome de Lynch. Cinco pacientes (20%) apresentaram variantes P/PP em MUTYH (3 bialélicos e 2 monoalélicos). Dois (8,3%) pacientes tinham variantes PP em FAN1. Um paciente apresentou uma variante PP em NTHL1 (monoalélica), e para os genes XRCC4 e RAD51C tivemos um paciente cada com alteração. Dois pacientes apresentaram variantes P/PP em mais de 1 gene (1 MLH1 com FAN1, 1 MUTYH com XRCC4). Conclusão: Em nosso trabalho fomos capazes de desenvolver com sucesso uma metodologia baseada em NGS para avaliação de metilação no promotor do gene MLH1, para caracterizar molecularmente as amostras tumorais do grupo de pacientes com deficiência nos genes de reparo relacionados a causas esporádicas (metilação de MLH1 e mutação de BRAF). Além disso, identificamos variantes germinativas com evidência definitiva de predisposição ao CCR em 1 a cada 4 pacientes da nossa coorte, além de termos identificado variantes patogênicas em genes com evidência limitada ou ausente de predisposição hereditária ao câncer CCR, como é o caso dos genes RAD51C, XRCC4 e FAN1.

Introduction: Patients with colorectal cancer (CRC) at a young age (< 50 years) are at greater risk of having germline variants in cancer predisposition genes, including Lynch Syndrome (LS) genes (MMR genes - MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2). Detecting the loss of expression of DNA mismatch repair (MMR) proteins is highly relevant to identify patients with Lynch syndrome. However, inactivation of MLH1 due to promoter hypermethylation occurs in 15% of sporadic colorectal cancers (CRCs) and is correlated with somatic BRAF mutations. Also, although the main hereditary syndromes of CRC represent 15-19% of cases of early-onset CRC, the etiology of most CRCs in these patients is unknown, even with up to 25% of these cases presenting an important family history of this neoplasm. Objective: To characterize the clinical and molecular phenotype (somatic and germline) of patients with CRC developed before the age of 50 years treated at the A.C.Camargo Cancer Center. Materials and Methods: Colorectal cancer patients <50 years were selected from the database of the Department of Pelvic Surgery or by referral from the Department of Oncogenetics. MLH1 promoter methylation analysis was performed by next-generation sequencing (NGS) from DNA converted by sodium bisulfite, in a methodology developed and validated in this study. BRAF mutation analysis was performed by amplicon NGS. For a subgroup of patients with specific clinical and molecular criteria (MMR deficient tumors, positive family history for CCR, KRAS:G12C mutation, and/or age <40 years) germline sequencing of CRC predisposing genes was performed. In the evaluation of germline variants, a multigene panel with 62 genes of known, emerging or unknown association for CRC predisposition was used. The identified variants were classified according to the criteria suggested by the American College of Medical Genetics (ACMG). Results: For MLH1 methylation analysis we used DNA from FFPE tumors and saliva was treated with bisulfite, amplified by PCR and evaluated by NGS. In MLH1/PMS2 deficient tumors, MLH1 methylation status was concordant with BRAF mutation status in 90% (18/20) of cases. Our amplicon-based NGS test showed great sensitivity and specificity for detecting MLH1 methylation in CRC samples, with high agreement with the BRAF mutation assessment. The evaluation of germline variants was performed in 89 patients, and we identified 24 (27%) patients with pathogenic or probably pathogenic (P/PP) variants. Most patients 53% (47/89) had variants of uncertain significance (VUS) and 18 (20%) patients had only variants without clinical significance for the 62 genes evaluated. Of the 24 patients with pathogenic variants, 16 (66.6%) had P/PP variants in Lynch syndrome genes. Five patients (20%) had P/PP variants in MUTYH (3 biallelic and 2 monoallelic). Two (8.3%) patients had PP variants in FAN1. One patient had a PP variant in NTHL1 (monoallelic), and for the XRCC4 and RAD51C genes we had one patient each with alteration. Two patients had P/PP variants in more than 1 gene (1 MLH1 with FAN1, 1 MUTYH with XRCC4). Conclusion: In our work, we were able to successfully develop a methodology based on NGS for the evaluation of methylation in the promoter of the MLH1 gene, to molecularly characterize the tumor samples from the group of patients with deficiency in the repair genes related to sporadic causes (MLH1 methylation and BRAF mutation). In addition, we identified germline variants with definitive evidence of predisposition to CRC in 1 out of 4 patients in our cohort, in addition to having identified pathogenic variants in genes with limited or no evidence of hereditary predisposition to CRC cancer, such as the RAD51C genes, XRCC4 and FAN1.

Historical review of Lynch syndrome / Revisão histórica da síndrome de Lynch

Lynch syndrome was formerly known as Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer. Currently, these two nomenclatures each have their unique definitions and are no longer used interchangeably. The history of hereditary nonpolyposis colorectal cancer was first recognized formally in the literature by Henry Lynch in 1967. With advances of molecular genetics, there has been a transformation from clinical phenotype to genotype diagnostics. This has led to the ability to diagnose affected patients before they manifest with cancer, and therefore allow preventative surveillance strategies. Genotype diagnostics has shown a difference in penetrance of different cancer risks dependent on the gene containing the mutation. Surgery is recommended as prevention for some cancers; for others they are reserved for once cancer is noted. Various surveillance strategies are recommended dependent on the relative risk of cancer and the ability to intervene with surgery to impact on survival. Risk reduction through aspirin has shown some recent promise, and continues to be studied. (AU)

A síndrome de Lynch era anteriormente conhecida como "câncer colorretal hereditário não polipose". Atualmente, essas duas nomenclaturas têm, cada uma, sua própria definição original e já não são empregadas de forma intercambiável. O histórico de câncer colorretal hereditário não polipose foi formalmente reconhecido pela primeira vez na literatura por Henry Lynch em 1967. Com os avanços da genética molecular, verificou-se uma mudança do fenótipo clínico para o diagnóstico genotípico. Esse fato levou à capacidade de diagnosticar pacientes afetados antes que o câncer se manifestasse, e, portanto, à utilização de estratégias preventivas de rastreamento. O diagnóstico genotípico mostrou a diferença na penetrância de diferentes riscos de câncer dependendo do gene que contem a mutação. A cirurgia é recomendada para a prevenção de alguns tipos de câncer; para outros, ela é reservada quando há o aparecimento da doença. Várias estratégias de rastreamento são recomendadas, dependendo do risco relativo de câncer, bem como a capacidade para intervir com a cirurgia objetivando um impacto na sobrevivência. A redução do risco através do uso de aspirina recentemente mostrou ser promissor e continua a ser estudada. (AU)

Mismatch repair genes in Lynch syndrome: a review: [review] / Genes de reparo de DNA na síndrome de Lynch: uma revisão: [revisão]

Lynch syndrome represents 1-7 percent of all cases of colorectal cancer and is an autosomal-dominant inherited cancer predisposition syndrome caused by germline mutations in deoxyribonucleic acid (DNA) mismatch repair genes. Since the discovery of the major human genes with DNA mismatch repair function, mutations in five of them have been correlated with susceptibility to Lynch syndrome: mutS homolog 2 (MSH2); mutL homolog 1 (MLH1); mutS homolog 6 (MSH6); postmeiotic segregation increased 2 (PMS2); and postmeiotic segregation increased 1 (PMS1). It has been proposed that one additional mismatch repair gene, mutL homolog 3 (MLH3), also plays a role in Lynch syndrome predisposition, but the clinical significance of mutations in this gene is less clear. According to the InSiGHT database (International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumors), approximately 500 different LS-associated mismatch repair gene mutations are known, primarily involving MLH1 (50 percent) and MSH2 (40 percent), while others account for 10 percent. Much progress has been made in understanding the molecular basis of Lynch Syndrome. Molecular characterization will be the most accurate way of defining Lynch syndrome and will provide predictive information of greater accuracy regarding the risks of colon and extracolonic cancer and enable optimal cancer surveillance regimens.

A síndrome de Lynch representa de 1-7 por cento de todos os casos de câncer colorretal. É uma síndrome de herança autossômica dominante que predispõe ao câncer e é causada por mutações nos genes de reparo de ácido desoxirribonucléico (DNA). Desde a descoberta dos principais genes com função de reparo de DNA, mutações nos genes MSH2, MLH1, MSH6, PMS2 e PMS1 estão relacionadas com a susceptibilidade à síndrome de Lynch. Outro gene, MLH3, tem sido proposto como tendo papel na predisposição à síndrome de Lynch, porém mutações de significância clínica nesse gene não são claras. De acordo com o banco de dados InSiGHT (International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumors), aproximadamente 500 diferentes mutações associadas à síndrome de Lynch são conhecidas, envolvendo primeiramente MLH1 (50 por cento), MSH2 (40 por cento) e outros (10 por cento). Grandes progressos têm ocorrido para nosso entendimento das bases moleculares da síndrome de Lynch. A caracterização molecular será a forma mais precisa para definirmos a síndrome de Lynch e irá fornecer informações preditivas mais precisas sobre o risco de câncer colorretal e extra-colônico, além de permitir regimes otimizados de manejo.

A importância da suspeição clínica no diagnóstico e tratamento do câncer colorretal hereditário / The importance of clinical suspicion on the diagnosis and treatment of hereditary colorectal cancer

Neste trabalho relatamos o caso de um paciente portador de síndrome de Lynch (HNPCC) que desenvolveu câncer retal metacrônico em curto intervalo de tempo após tratamento do tumor primário (câncer de cólon direito). O objetivo deste relato de caso é salientar a importância da suspeição clínica no diagnóstico de câncer colorretal hereditário e suas implicações terapêuticas.

In this article we report the case of a patient with Lynch syndrome (HNPCC) who developed metachronic rectal cancer in a short time interval after the primary tumor had been treated (right colon cancer). The objective of this case report is to point out the importance of clinical suspicion in the diagnosis of hereditary colorectal cancer and its therapeutics implications.