PEGylation strategy to the development of analytical and therapeutic proteins / Potencial da PEGuilação para o desenvolvimento de proteínas para fins terapêuticos e analíticos

Protein PEGylation is the covalent bonding of polyethylene glycol (PEG) polymers to amino acid residues of the protein and it is one of the most promising techniques for improving the therapeutic effect of biopharmaceuticals and long-term stability of protein-based biosensors. This chemical modification brings advantages to biopharmaceuticals, such as an increased half-life, enhanced stability, and reduced immunogenicity. Moreover, in the analytical field, PEGylation improves the multiple properties of protein-based biosensors including biocompatibility, thermal and long-term stability, and solubility in organic solvents. However, the use of PEGylated conjugates in the analytical and therapeutic fields has not been widely explored. The limited industrial application of PEGylated bioconjugates can be attributed to the fact that the reaction and separation steps are currently a challenge. The correct selection of the PEGylation reaction design and the purification process are important challenges in the field of bioconjugation. In this sense, the design and optimization of site-specific PEGylation reactions and application of aqueous biphasic systems (ABS) as purification platforms for PEGylated conjugates are the two main objectives of this thesis. Regarding the purification step, the efficient fractionation (i) of the PEGylated conjugates from the native protein and (ii) of the PEGylated conjugates based on their degree of PEGylation was studied. Centrifugal partition chromatography (CPC) was applied as a continuous regime platform based on ABS technology to efficiently purify the PEGylated proteins. The two proteins under study are L-asparaginase, an important biopharmaceutical applied in the treatment of acute lymphoblastic leukemia and cytochrome c, a promising biosensor. The current work developed in this thesis demonstrates the great potential of ABS in the fractionation of PEGylated proteins, under batch and continuous regime. In addition, in situ recovery of the PEGylated products through one-pot bioconjugation and ABS purification was successfully demonstrated for both enzymes studied. Although further research on scale-up is still required, the results presented show the relevance of ABS platforms for the development of separation processes of PEGylated proteins

A PEGuilação de proteínas é a ligação covalente de polímeros de polietilenoglicol (PEG) a resíduos de aminoácidos da proteína e é uma das técnicas mais promissoras para melhorar o efeito terapêutico dos biofármacos e a estabilidade a longo prazo de biossensores proteícos. Esta modificação química traz vantagens aos produtos biofarmacêuticos, como um aumento da meia-vida, maior estabilidade e imunogenicidade reduzida. Além disso, no campo analítico, a PEGuilação melhora as múltiplas propriedades dos biossensores baseados em proteínas, incluindo biocompatibilidade, estabilidade térmica e a longo prazo, e solubilidade em solventes orgânicos. No entanto, o uso de conjugados PEGuilados em campos analíticos e terapêuticos não tem sido amplamente explorado. A aplicação industrial limitada dos bioconjugados PEGuilados pode ser atribuída ao facto de as etapas de reacção e separação serem atualmente um desafio. A seleção correcta do design da reacção de PEGuilação e do processo de purificação são importantes desafios no campo da bioconjugação. Neste sentido, a concepção e otimização de reações de PEGuilação sítio-específicas e aplicação de sistemas aquosos bifásicos (ABS) como plataformas de purificação de conjugados PEGuilados são os dois principais objetivos desta tese. No que concerne à etapa de purificação foi estudado o eficiente fracionamento (i) dos conjugados PEGuilados, da proteína nativa e (ii) dos conjugados PEGuilados baseados no seu grau de PEGuilação. A cromatografia por partição centrífuga (CPC) foi aplicada como uma plataforma de regime contínuo baseada na tecnologia de ABS para purificar eficientemente as proteínas PEGuiladas. As duas proteínas em estudo são a L-asparaginase, importante biofármaco aplicado no tratamento da leucemia linfoblástica aguda e o citocromo c, um potencial biossensor. A partir dos trabalhos desenvolvidos, é possível confirmar o grande potencial dos ABS no fracionamento de proteínas PEGuiladas, em regime contínuo e descontínuo. Além disso, a recuperação in situ dos produtos PEGuilados através da integração em uma única etapa de bioconjugação e purificação por ABS foi comprovada com sucesso para ambas as enzimas estudadas. Embora ainda sejam necessários estudos adicionais sobre a viabilidade destes sistemas em larga escala, os resultados aqui apresentados demonstram a relevância dos ABS para o desenvolvimento de processos de separação de proteínas PEGuiladas

Alopecia por tração simulando alopecia cicatricial central centrífuga: importante diagnóstico diferencial em pacientes melanodérmicos / Traction alopecia simulating central cicatricial centrifugal alopecia: important differential diagnosis in melanodermic patients

Introdução: A alopecia por tração (AT) e a alopecia cicatricial central centrífuga (ACCC) merecem destaque nas afecções capilares que acometem pacientes melanodérmicos, por serem atribuídas a penteados, produtos químicos, equipamentos e/ou acessórios utilizados para tratamento capilar estético. Constituem um importante diagnóstico diferencial diante de suas características clínicas e dermatoscópicas. Relatamos um caso de AT cujo diagnóstico foi dificultado pelas características clínicoepidemiológicas compatíveis com ACCC. Relato do caso: Paciente feminina, 51 anos, melanodérmica, com queixa de queda de cabelos em vértice e região parietal. Antecedentes de uso de tinturas e alisamentos capilares. A dermatoscopia mostrou número total de fios terminais diminuídos, áreas sem hastes. O exame histopatológico de biópsia confirmou diagnóstico compatível com alopecia por tração. Foi realizado o esclarecimento da paciente com relação aos fatores causais e prescrição de minoxidil 5%, uma vez ao dia. Resultados: Após três meses houve repilação parcial. Conclusão: Os achados histopatológicos foram de fundamental importância para a elucidação diagnóstica do caso em questão, devido à topografia acometida, que tipicamente está afetada na ACCC. Para que o diagnóstico falasse a favor de ACCC o exame histopatológico deveria apresentar um infiltrado linfocítico desde as porções mais profundas do folículo piloso terminal até a porção superior do istmo. Áreas de fibrose podem ser encontradas em ambas as entidades clínicas.

Análise da infra-estrutura existente em unidades de produção agrícola para processamento de mel na região do Vale do Paraíba-SP / Analysis of production unit infrastructure of honey processing agricultural in the Paraiba Valley, São Paulo state-Brazil

Objetivou-se neste trabalho analisar a existência de infra-estrutura para processamento de mel, em Unidades de Produção Agrícola-UPAs na região do Vale do Paraíba-SP. Para a realização desse trabalho utilizou-se o método de levantamento dos dados primários através de questionário. No período de janeiro de 2005 a março de 2006 realizou-se o trabalho com a amostra de 116 UPAs, que representam 33,7 por cento do total de unidades onde há atividade apícola. Para avaliar-se a associação e a relação de dependência entre as variáveis equipamentos, casa do mel, escolaridade, tempo na atividade e número de colméias na UPA, utilizou-se o teste do qui-quadrado X² . Os resultados revelaram que a centrífuga está presente em 58,6 por cento das UPAs e a casa do mel em 29,3 por cento das UPAs das unidades da região. O nível de escolaridade, tempo de permanência do apicultor na atividade e o número de colméias são variáveis que estabelecem relações significativas com a existência de centrífuga e de casa do mel na UPA.

The aim of this paper is to analyze the infrastructure for honey process in Agricultural Production Units (UPAs) located in the Paraíba Valley (São Paulo state, Brazil). For this study to be carried out, the search of primary data method using a questionnaire was applied. From January 2005 to March 2006, 116 UPAs samples, representing 33.7 percent of all bee-related UPAs were used. For the association and relation of dependence among the equipment variables, "casa do mel", staff education level, time in the activity and number of bee-hives in the UPA, the chi-square (X²) statistical tests were applied. The results revealed that centrifuges were present in 58.6 percent of UPAs, while the type of "casa do mel" occured in 29.3 percent of UPAs in the region. The staff education level, time in the activity and number of bee-hives are variables which are important when considering the existence of centrifuges and "casa do mel" in the UPA.