Diferencias fenotípicas de fibroblastos gingivales en sujetos con hiperplasia gingival idiopática frente a sujetos periodontalmente sanos: estudio piloto / Phenotypic differences of gingival fibroblasts in subjects with idiopathic gingival hyperplasia versus periodontally healthy subjects: a pilot study

Objetivo: identificar, describir y diferenciar las características fenotípicas de los fibroblastos gingivales (FGs) en pacientes con hiperplasia gingival idiopática (HGI) e individuos periodontalmente sanos. Métodos: los FGs fueron aislados a partir de tejido gingival de individuos periodontalmente sanos (n=2) y pacientes con HGI (n=2). Los FGs se cultivaron en el medio DMEM (Dulbecco's Modified of Eagle Medium) a 37°C con 5% de CO2. La identificación y localización de la actina, vimentina y mitocondrias en FGs fue realizada y evaluada microscópicamente mediante inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales. La capacidad de migración de los FGs en los pacientes con HGI e individuos sanos también fue estudiada. Resultados: todos los FGs fueron mononucleares, fusiformes y con prolongaciones citoplasmáticas visibles. La faloidina permitió identificar una densa red de actina en los FGs de pacientes con HGI, contrariamente a los FGs de individuos periodontalmente sanos. La vimentina y mitocondrias fueron identificadas en los FGs de individuos sanos y pacientes con HGI sin ninguna alteración en su expresión y localización. La migración de la monocapa de los FGs indicó una actividad de migración celular importante en los FGs de los pacientes con HGI, en relación a los FGs de los individuos periodontalmente sanos. Conclusión: los FGs de pacientes con HGI conservan características fenotípicas celulares similares a los FGs de individuos periodontalmente sanos. Sin embargo, los FGs de pacientes con HGI simulan tener una mayor capacidad migratoria que amerita ser explorada en futuros trabajos de investigación.

Objective: To identify and to describe the phenotypic characteristics of gingival fibroblasts from patients with idiopathic gingival hyperplasia (IGH) and periodontally healthy individuals. Methods: Gingival fibroblasts (GFs) were isolated from gingival tissue from periodontally healthy individuals (n=2) and patients with IGH (n=2). The GFs were grown in DMEM (Dulbecco's Modified of Eagle Medium) at 37°C with 5% CO2. The identification and location of actin, vimentin and mitochondria in GFs were performed and evaluated microscopically by immunofluorescence with monoclonal antibodies. The migration capacity of GFs from IGH and healthy individuals was also studied. Results: All the GFs were mononuclear, fusiform and with visible cytoplasmic extensions. The phalloidin allowed to identify a dense actin network in the GFs of patients with IGH, contrary to the GFs of periodontally healthy individuals. Vimentin and mitochondria were identified in the GFs of healthy individuals and patients with IGH without any alteration in their expression and location. Monolayer migration of GFs indicates significant cell migration activity in the GFs of patients with IGH in relation to the GFs of periodontally healthy individuals. Conclusion: GFs from patients with IGH retain cellular phenotypic characteristic similar to GFs from periodontally healthy individuals. However, the GFs of patients with IGH simulate having a greater migratory capacity that deserves to be explored in future research works.

Supervivencia de células fibroblásticas humanas en ausencia de suplementación / Survival of Human Fibroblastic Cells in the Absence of Supplementation

Resumen Introducción. Los fibroblastos gingivales (FGs) son células del tejido conjuntivo gingival que han tomado en los últimos años una relevancia promisoria por su probable utilización en la terapia celular, dadas sus capacidades de multipotencialidad y de autorrenovación. Objetivo. Conocer y describir el impacto de la ausencia en la suplementación de Suero Fetal Bovino (SFB) en la supervivencia de fibroblastos gingivales en cultivos. Materiales y métodos. Fibroblastos gingivales fueron aislados de tejido gingival de pacientes sanos y cultivados en medios de cultivos DMEM (Dulbecco's Modified of Eagle Medium) en ausencia y suplementados con 0.2% de SFB a 37°C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2. Se llevó a cabo una evaluación morfológica, de supervivencia y proliferación de los FGs, así como la identificación mediante la técnica de inmunofluorescencia de marcadores del citoesqueleto celular como la actina y mitocondrias. Resultados. Los FGs cultivados en ausencia y con suplementación de 0.2% de SFB evidenciaron una forma fusiforme, con núcleos ovalados y numerosas prolongaciones citoplasmáticas durante el tiempo de cultivo. Un leve aumento en la proliferación de FGs fue observado en aquellas células en contacto con el medio DMEM+0.2% de SFB comparadas con el medio donde estuvo ausente la suplementación. El inmunomarcaje de la actina y las mitocondrias dejó en evidencia que la ausencia y suplementación a 0.2% de SFB no afectó su localización en los FGs evaluados. Conclusión. Los fibroblastos gingivales sobreviven y proliferan en ausencia de SFB, conservando sus características morfológicas celulares.

Abstract Introduction. Gingival fibroblasts (GF) are cells of gingival connective tissue that have taken promising relevance in recent years due to their probable use in cell therapy, given their multipotencial and self-renewal capabilities. Objective. To know and to describe the impact of the absence of Fetal Bovine Serum (FBS supplementation on the survival of gingival fibroblasts in cultures. Materials and methods. Gingival fibroblasts were isolated from gingival tissue of healthy patients and cultured in DMEM (Dulbecco's Modified of Eagle Medium) culture media in absence and supplemented with 0.2% FBS at 37 ° C in a humid atmosphere with 5% CO2. A morphological evaluation, survival and proliferation of GF were carried out, as well as the identification by the immunofluorescence technique of cellular cytoskeleton markers such as actin and mitochondria. Results. The GF grown in the absence and with supplementation of 0.2% FBS showed a fusiform shape, with oval nuclei and numerous cytoplasmic extensions during the culture time. A slight increase in the proliferation of GF was observed in those cells in contact with the DMEM medium +0.2% FBS compared to the medium where the supplementation was absent. Immunostaining of actin and mitochondria showed that the absence and supplementation to 0.2% of FBS did not affect its location in the evaluated. Conclusion. Gingival fibroblasts survive and proliferate in the absence of FBS, preserving their cellular morphological characteristics.

Participação da GTPase Rho na dinâmica do complexo juncional apical e do citoesqueleto de actina na progressão do câncer colorretal

A desmontagem do complexo juncional apical (CJA), que compreende as junções aderentes (JAs) e junções tight (JTs), e a reorganização do citoesqueleto de actina são etapas iniciais da progressão do câncer colorretal (CCR). Subsequentemente, as células adquirem um fenótipo migratório e invasivo, no entanto, os mecanismos moleculares que modulam esses eventos iniciais permanecem desconhecidos. O objetivo do presente estudo foi identificar as vias de sinalização envolvidas na regulação da dinâmica do CJA e do citoesqueleto de actina durante a progressão do CCR. Células de adenocarcinoma de cólon humano Caco-2, utilizadas como modelo de CCR, foram submetidas ao ensaio de retirada do cálcio do meio extracelular e ao tratamento com ácido lisofosfatídico (LPA), um ativador da GTPase Rho. Pré-tratamentos com inibidores específicos de vias de sinalização foram também utilizados nos diferentes ensaios. Na primeira etapa do estudo, verificamos que a retirada do cálcio extracelular ocasionou redistribuição das proteínas do CJA, conforme mostrado por imunofluorescência e immunoblotting usando frações solúveis e insolúveis em Triton X-100; perda da funcionalidade das JTs, como visto pelo decréscimo na resistência elétrica transepitelial (RET) e microscopia eletrônica de transmissão utilizando o traçador vermelho de rutênio; alterações no citoesqueleto de actina na região perijuncional e na distribuição das fibras de estresse, observados por microscopia confocal; e ativação localizada das GTPases Rho e Rac. Todos esses efeitos foram mediados por uma via de sinalização envolvendo a ativação de PKA e Rho-ROCK. Na segunda parte do estudo, observamos que o tratamento com LPA ocasionou redistribuição das proteínas do CJA e redução da expressão de E-caderina bem como reorganização do citoesqueleto de actina perijuncional, e aumento na formação de fibras de estresse. Além disso, o LPA causou: aumento da migração, mas não da invasão celular, como mostrado pelas técnicas do wound healing e de invasão em matrigel, respectivamente; formação de adesões focais, analisada pelo aumento da fosforilação da quinase de adesão focal (FAK) e imunofluorescência; ativação da GTPase Rho, mas não de Rac, conforme o ensaio de pull-down; e aumento do crescimento independente de ancoragem. Esses resultados mostram que o LPA modula as JAs, o citoesqueleto de actina e a migração celular através de uma via de sinalização que integra Rho-ROCK e Src-FAK. Em conclusão, juntos esses resultados mostram um papel central da via de sinalização Rho-ROCK na modulação do CJA e do citoesqueleto de actina durante a progressão do CCR, via que pode constituir um novo e alternativo alvo terapêutico no tratamento deste tipo de câncer

A desmontagem do complexo juncional apical (CJA), que compreende as junções aderentes (JAs) e junções tight (JTs), e a reorganização do citoesqueleto de actina são etapas iniciais da progressão do câncer colorretal (CCR). Subsequentemente, as células adquirem um fenótipo migratório e invasivo, no entanto, os mecanismos moleculares que modulam esses eventos iniciais permanecem desconhecidos. O objetivo do presente estudo foi identificar as vias de sinalização envolvidas na regulação da dinâmica do CJA e do citoesqueleto de actina durante a progressão do CCR. Células de adenocarcinoma de cólon humano Caco-2, utilizadas como modelo de CCR, foram submetidas ao ensaio de retirada do cálcio do meio extracelular e ao tratamento com ácido lisofosfatídico (LPA), um ativador da GTPase Rho. Pré-tratamentos com inibidores específicos de vias de sinalização foram também utilizados nos diferentes ensaios. Na primeira etapa do estudo, verificamos que a retirada do cálcio extracelular ocasionou redistribuição das proteínas do CJA, conforme mostrado por imunofluorescência e immunoblotting usando frações solúveis e insolúveis em Triton X-100; perda da funcionalidade das JTs, como visto pelo decréscimo na resistência elétrica transepitelial (RET) e microscopia eletrônica de transmissão utilizando o traçador vermelho de rutênio; alterações no citoesqueleto de actina na região perijuncional e na distribuição das fibras de estresse, observados por microscopia confocal; e ativação localizada das GTPases Rho e Rac. Todos esses efeitos foram mediados por uma via de sinalização envolvendo a ativação de PKA e Rho-ROCK. Na segunda parte do estudo, observamos que o tratamento com LPA ocasionou redistribuição das proteínas do CJA e redução da expressão de E-caderina bem como reorganização do citoesqueleto de actina perijuncional, e aumento na formação de fibras de estresse. Além disso, o LPA causou: aumento da migração, mas não da invasão celular, como mostrado pelas técnicas do wound healing e de invasão em matrigel, respectivamente; formação de adesões focais, analisada pelo aumento da fosforilação da quinase de adesão focal (FAK) e imunofluorescência; ativação da GTPase Rho, mas não de Rac, conforme o ensaio de pull-down; e aumento do crescimento independente de ancoragem. Esses resultados mostram que o LPA modula as JAs, o citoesqueleto de actina e a migração celular através de uma via de sinalização que integra Rho-ROCK e Src-FAK. Em conclusão, juntos esses resultados mostram um papel central da via de sinalização Rho-ROCK na modulação do CJA e do citoesqueleto de actina durante a progressão do CCR, via que pode constituir um novo e alternativo alvo terapêutico no tratamento deste tipo de câncer